CRISPR文库一站式服务

Vemurafenib是突变的蛋白激酶BRAF的抑制剂，被批准用于晚期黑色素瘤的治疗，对存在V600E BRAF突变的黑色素瘤有治疗效果。Shalem等[1]设计了靶向全基因组18080个基因、包含64751条sgRNA的GeCKO敲除文库，而后构建慢病毒载体将GeCKO文库转染进携带V600E BRAF突变的黑色素瘤细胞A375中，通过加入Vemurafenib抑制A375细胞生长来富集少数具有Vemurafenib药物抗性的细胞。对这部分细胞的sgRNA序列进行分析，筛选出nf1、med12、nf2、cul3、tada2b和tada1等敲除后能使细胞对Vemurafenib产生抗性的基因，提出了新的Vemurafenib肿瘤耐药机制假说。

合成致死指当两个非致死性突变基因单独发生时不会导致细胞死亡，而同时发生时会引起细胞死亡的现象，是目前抗肿瘤药物领域新的研究方向之一。因为肿瘤细胞往往带有许多点突变，如何特异性地杀伤突变率高的肿瘤细胞而不影响正常细胞是抗肿瘤药物研发的一大追求。Shen等[2]从合成致死这一思路出发，设计了双重gRNA文库筛选出合成致死相互作用网络。与一般的sgRNA文库不同，双重gRNA文库中每个载体包含两条gRNA，一条靶向肿瘤中常见的突变肿瘤抑制基因，另一条靶向可以被抗癌药物扰乱的基因。他们运用该系统对3种实验癌细胞系（人宫颈癌Hela、肺癌A549和胚胎肾细胞癌293T）中的73个基因进行了筛选，共约150,000种基因组合，通过检测不同时间点gRNA丰度变化，进一步分析筛选出120种合成致死相互作用关系，为癌症新药的开发提供了新靶点。

HIV病毒感染引发的艾滋病(AIDS)严重威胁着人类的生命健康，阐明HIV突破宿主细胞防御系统的分子机制、开发HIV治疗新靶点具有重大意义。Park等[3]在CCR5-hygR和HIV-1 LTR-GFP稳定表达的CCRF-CEM细胞上感染Cas9病毒，筛选出一株HIV感染前高表达CCR5、低表达EGFP但感染后高表达EGFP的克隆株（GXRCas9细胞）用作筛选HIV感染靶点的工具细胞。具体是使用包含187 536条sgRNA (靶向18 543个基因)的慢病毒文库感染GXRCas9细胞，再用HIV病毒株JR-CSF感染这些缺失不同受体的T细胞，随后流式分选出GFP阴性和阳性的T细胞，并对GFP阴性细胞群与未感染HIV病毒细胞群进行测序，分析两群细胞sgRNA的丰度差异，最后筛选出5个sgRNA丰度变化最大的基因。其中CD4和CCR5是HIV感染T细胞的受体，TPST2和SLC35B2对CCR5进行修饰为HIV的结合提供便利，而编码白细胞粘附因子ALCAM的基因则与HIV在细胞间的传播有关。筛选出的5个基因被敲除后均不影响T细胞的存活，但能使T细胞抵抗HIV的感染，因此这5个基因可作为HIV治疗的潜在靶标，为预防和治疗艾滋病提供新的理念和途径。

单克隆抗体特异性靶标抗原及其表位的识别

使用肽或纯化蛋白进行免疫实验验证抗体是相当简单的，但使用全细胞或其他复杂抗原进行免疫验证抗体则相对困难。如果Western blotting (蛋白印迹)和免疫沉淀中均未检测到抗体的反应性，则需要应用多种基因操作层面的技术来确定mAb的抗原特异性。BF4是一种能与未感染的淋巴细胞、中性粒细胞及HTLV-1感染细胞表面的病毒生物膜结合的抗体。Zotova等[4]以MT2细胞（人T细胞嗜淋巴病毒Ⅰ型HTLV-1慢性感染T细胞）作为免疫原触发小鼠免疫获得了一株HTLV-1生物膜特异性单克隆抗体BF4。他们基于通过向BF4阳性细胞中转导CRSIPR knockout 文库以筛选出BF4抗原被敲除的细胞的思路，在CEM T和Raji/CD4 B细胞上转导GeCKO文库，将不与BF4结合的细胞分选出来。经过两轮的重复分选后，阴性细胞比例达到了99%以上。研究人员对这部分细胞进行测序分析，发现约80%的sgRNA靶向了CD82。经验证确定BF4是CD82的特异性抗体。

细胞焦亡的机制研究：

细胞焦亡是机体在感知病原微生物浸染后启动的免疫防御反应。炎症激活的caspase-1和识别细菌脂多糖的caspase-4、caspase-5和caspase-11都能够引起细胞焦亡，但其机制仍未探知。Shi等[5]首先建立了能诱导90%以上细胞焦亡的脂多糖(LPS)电转法，接着向能够对脂多糖刺激产生正常反应的Tlr4–/–骨髓源永生化巨噬细胞(iBMDMs)转导CRISPR knockout文库，并对脂多糖诱导细胞焦亡后存活的细胞进行测序分析。分析结果显示，5条靶向gasdermin D (GSDMD)基因的sgRNA中有4条拷贝数在前30，其中有2条更处于前10位置，后续的结果也进一步证明GSDMD的N端能够诱导细胞焦亡。综上所述，研究人员使用CRISPR基因文库进行了全基因组范围的遗传筛选，成功筛选到了敲除后能够抑制细胞焦亡的基因GSDMD，并阐明了GSDMD作为炎症caspase底物蛋白在被切割后能够引发细胞焦亡的分子机制。