CRISPR文库：为病毒研究打开新视角——初阶干货（一）

CRISPR文库：为病毒研究打开新视角——初阶干货（一）

在抗击病毒的科研路上，CRISPR文库以其强大的功能，为我们揭示病毒与宿主细胞间微妙的相互作用。小源以CRISPR文库在流感病毒研究中的应用为例，带您一探CRISPR文库如何为病毒研究打开新视角！

研究背景

流感病毒是全球公共卫生的重大威胁，每年导致大量的发病和死亡，其快速变异的特性给疫苗研发带来挑战。因此，需要寻找更有效、更广谱的抗流感策略。近年来，宿主导向的抗病毒治疗策略 备受关注，这种方法不直接针对病毒本身，而是通过调整宿主细胞的特性来限制病毒的感染和复制，展现出潜在的广谱性和抗耐药性优势，为抗流感策略提供了新的方向。

摘要

Trimarco等人们采用了CRISPR激活文库筛选技术，来寻找能够限制流感病毒的宿主因子。他们使用乙型流感病毒（IBV）对细胞进行处理，然后利用CRISPR-Cas9系统激活宿主基因，寻找那些能够提高细胞抗病毒感染能力的基因。通过这种方法，他们发现了B3GAT1基因，它编码一种名为β-1,3-葡萄糖醛酸转移酶1的酶，能够改变细胞表面的糖链结构，从而影响病毒的感染。

CRISPR文库发现病毒限制因子

文库类型：人全基因组激活CRISPR文库（Addgene 92379）

转导细胞：A549细胞

病毒：B/Yamagata/16/1988株流感病毒

筛选思路：三轮病毒感染，正向筛选

筛选方法：

每个组收集一半的文库稳转细胞，于-80℃储存。每组剩余的另一半细胞，感染B/Yamagata/16/1988病毒，并在含有TPCK处理胰酶的培养基中孵育24小时，以促进多轮感染。随后，将培养基更换为DMEM培养基，并培养48小时，以充分展现病毒感染后的细胞病变效应。接着，使用胰酶处理细胞，重新铺板以去除死亡细胞，继续培养。当细胞生长至初始细胞数时，收集一半的细胞，加入裂解液储存，并将剩余的另一半细胞再次感染病毒。这一生长、细胞收集和再次感染的过程重复了两次，总共进行了三轮感染，直到两组细胞在感染后均未表现出明显的细胞病变效应。提取每轮感染后细胞的基因组DNA，使用高通量测序技术对sgRNA进行深度测序。利用生物信息学工具分析测序数据，识别富集的sgRNA，从而确定候选的抗病毒宿主基因。

图1 全基因组激活CRISPR文库筛选确定B型流感病毒的限制性因子

研究者推断，反复感染将使富集的基因内部竞争，最终导致群体受到瓶颈限制，最后只包含少数具有强抗病毒活性的基因。正如预期那样，检测到的sgRNA数量在每⼀轮感染中都会减少，少数sgRNA的计数在群体中变得越来越突出。

对最有希望的筛选结果进行验证，研究者选择了结果中前六个富集程度最高的sgRNA靶向基因。其中，B3GAT1基因以前未被明确描述为病毒限制因子，但展现出了显著的抗病毒活性，因此研究者选择了B3GAT1基因进行深入的表征研究。

B3GAT1的功能验证

研究者们使用报告病毒株感染B3GAT1过表达的A549细胞，通过流式细胞技术和免疫荧光显微镜观察到病毒感染被抑制。

图2 B3GAT1过表达的A549细胞验证

B3GAT1抗病毒机制研究

B3GAT1是一种糖基转移酶，它是否通过改变细胞表面的聚糖组成来发挥作用。研究者利用MALDI-TOF质谱技术，分析了B3GAT1过表达细胞与对照细胞的N－连接聚糖。发现B3GAT1过表达细胞中，含有唾液酸的聚糖种类减少，而含有葡萄糖醛酸（GlcA）的聚糖种类增多。使用不同的荧光标记凝集素和特异性抗体来检测细胞表面的唾液酸和GlcA表达，发现B3GAT1表达减少了α2,3－和α2,6－连接的唾液酸表达。值得注意的是，许多病毒都需要唾液酸才能进入宿主细胞。