基因敲入细胞系的原理，是通过 基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）在基因组特定位点产生DNA双链断裂（DSB） ，并引入一个含有目标插入片段和 同源臂（homology arms）的供体DNA模板。细胞利用自身的同源定向修复（HDR）机制 ，在修复断裂时 精确插入目标序列 ，从而在基因组中实现稳定敲入。该方法可用于插入报告基因、标签序列（如GFP、FLAG），广泛应用于功能研究、化合物筛选和疾病模型构建等领域。

1) 靶点设计与供体构建

• a) 设计CRISPR/Cas9系统中的gRNA，引导Cas9在目标位点切割DNA
• b) 构建供体DNA模板，通常包含：
  • i) 左右同源臂（一般为500–1000 bp）
  • ii) 插入片段（如标签、报告基因、突变位点）

2) 细胞转染（或转导）

• a) 将Cas9/gRNA表达载体或RNP复合物，与供体DNA一起导入细胞
• b) 常用方法包括电转、电穿孔、脂质体转染或病毒转导（如AAV）

3) 同源定向修复（HDR）介导插入

• a) 细胞在S/G2期通过HDR机制修复Cas9切口，整合供体片段
• b) 可配合使用 源井CRISPR-U™技术 提升HDR效率（如调控细胞周期、抑制NHEJ）

4) 筛选与克隆化培养

• a) 使用抗性筛选（如抗生素）或荧光标记富集阳性细胞
• b) 单细胞克隆培养，获得稳定表达的阳性克隆

5) 基因型验证

• a) 采用PCR、Sanger测序等手段确认插入的正确性与表达情况
• b) 可选NGS检测排查脱靶风险

敲入的基因在正确构建后通常是稳定的 ，尤其是在经过筛选和验证的 单克隆细胞系 中。

• 1) 整合于基因组中：
  敲入片段通过同源定向修复（HDR）被精准整合进基因组特定位点（如外显子、启动子或安全位点），在无外源选择压的情况下仍可稳定传代表达。
• 2) 经过单克隆筛选：
  项目中会进行 单细胞克隆化培养和扩增 ，排除混杂群体，确保每株细胞都来自同一稳定整合事件。
• 3) 遗传稳定性验证：
  优质服务通常会提供多代培养后的验证数据（如qPCR、测序），确认基因敲入后在细胞传代过程中的持续表达和位点稳定性。