通过核转染法将 gRNA 与 Cas9 蛋白组装而成的 RNP 复合物以及携带目标点突变的单链 Oligo 共转入细胞，然后使用极限稀释法分离单克隆。RNP 复合物对靶位点造成DNA双链断裂后，细胞以Oligo作为模板进行同源重组修复（HDR），将目标点突变重组到基因组靶位点。最后对靶位点进行扩增及测序验证，筛选出突变的阳性克隆。
EZ-HRex™新技术
源井生物经过数年研发，在原CRISPR-U™基因编辑技术的基础上， 创新性地添加U+分子，将该技术升级为EZ-HRex™。 技术升级后，细胞基因突变和片段敲入的HDR效率得到全面提升，转染后Cell Pool水平的, HDR基因型占比高达84%
有效调节细胞周期，促进转染后更多细胞进入S/G2期。
降低NHEJ途径活性，减少indel基因型占比，提高HDR效率。
在线咨询 点突变方案
4种点突变方案，满足不同突变需求
RNP法
将sgRNA和Cas9蛋自在体外孵育形成RNP复合物，与单链oligo共转进细胞内。RNP造成靶点双链断裂后，oligo可通过同源重组的方式，将携带的目标突变引入基因组靶点。
特点：
普遍适用，编辑效率较高，周期较短。
适用类型：
突变位点附近(~10bp内)可以找到gRNA序列，细胞可以用电转或脂质体转染。
先导编辑器
通过将工程化的逆转录酶与Cas9单切口酶融合，并结合一种特殊的prime editing guide RNA（pegRNA）来实现基因编辑。
特点：
可修复多种复杂突变，但编辑效率较低，载体设计复杂。
适用类型：
复杂突变，以及突变位点附近无法找到合适的gRNA序列。
单碱基编辑器
将碱基脱氨酶与CRISPR/Cas系统整合开发出的单碱基编辑系统，可在不切断DNA双链的情况下精准引入C/G-T/A及A/T-G/C点突变，从而实现高效精准的基因编辑。
特点：
高效，但符合要求的需求较少。
适用类型：
满足特定单碱基变换（C⇌T；A⇌G），且只有目标位点在活性窗口内。
质粒抗性法
Donor用质粒构建，在内含子插入一个抗性基因表达盒，通过药筛提高点突变重组效率。
特点：
适用突变位点附近无法找到合适gRNA序列的需求，费用较高，周期较长。
适用类型：
适用突变位点附近无法找到合适gRNA序列的需求。
将sgRNA和Cas9蛋自在体外孵育形成RNP复合物，与单链oligo共转进细胞内。RNP造成靶点双链断裂后，oligo可通过同源重组的方式，将携带的目标突变引入基因组靶点。
特点：
普遍适用，编辑效率较高，周期较短。
适用类型：
突变位点附近(~10bp内)可以找到gRNA序列，细胞可以用电转或脂质体转染。
服务流程及质量控制
红棉设计点突变方案
RNP体系
细胞转染
pool效率验证
单克隆制备
PCR扩增
测序验证
质量检测、细胞冻存
A549细胞MYC基因——肺癌
IF=20.8
Nature Metabolism
Acetate reprogrammes tumour metabolism and promotes PD-L1 expression and immune evasion by upregulating c-Myc
该研究表明乙酸是人类非小细胞肺癌组织中最丰富的短链脂肪酸，随着肿瘤富集的乙酸摄取增加。研究采用了源井生物构建MYC（p.K148R）点突变的A549细胞，MYC（p.K148Q）点突变的A549细胞，模拟乙酰化和非乙酰化的c-Myc状态，并研究这些改变对肿瘤细胞行为的影响。 查看详情>>
点击放大HEK293细胞FOXP1基因——肿瘤发生
IF=9.4
The EMBO Journal
FOXP1 phosphorylation antagonizes its O-GlcNAcylation in regulating ATR activation in response to replication stress
该研究揭示了叉头框（forkhead box,FOX）转录因子FOXP1促进复制压力下ATR-CHK1活化的新机制，该功能不依赖于FOXP1的转录调控活性，并且由FOXP1的磷酸化修饰和糖基化修饰交互调控。研究采用了源井生物构建FOXP1基因S396A和S396D点突变HEK293细胞系。
点击放大1. 基因点突变细胞系是什么？有哪些类型？
基因点突变细胞系（Point Mutation Cell Line）是一类在特定位点上引入一个或几个碱基变化（点突变）的细胞模型，广泛用于研究疾病致突变、蛋白功能调控、化合物敏感性分析等。
| 类型 | 描述 | 示例 |
|---|---|---|
| 错义突变（Missense Mutation） | 将一个碱基替换为另一个，改变一个氨基酸 | G>A → Arg > His |
| 无义突变（Nonsense Mutation） | 使编码氨基酸的密码子变为终止密码子，导致蛋白提前终止 | C>T → Gln > Stop |
| 沉默突变（Silent Mutation） | 改变密码子但不改变氨基酸 | A>G → Leu > Leu |
| 启动子/剪接区突变 | 改变基因表达调控或mRNA剪接 | 改变splice donor/acceptor序列 |
| 耐药突变/功能增强突变 | 常用于化合物敏感性/抗性研究 | EGFR T790M、KRAS G12D 等 |
| 疾病相关SNV | 与已知疾病或遗传表型相关的突变 | TP53 R175H、HBB E6V（镰状细胞病） |
2. 基因点突变细胞系的方法有哪些？
一、RNP法
- ● 将sgRNA和Cas9蛋自在体外孵育形成RNP复合物，与单链oligo共转进细胞内。RNP造成靶点双链断裂后，oligo可通过同源重组的方式，将携带的目标突变引入基因组靶点。
- ● 特点：普遍适用，编辑效率较高，周期较短。
- ● 适用类型:突变位点附近可以找到gRNA序列，细胞可以用电转或脂质体转染。
二、先导编辑器
- ● 通过将工程化的逆转录酶与Cas9单切口酶融合，并结合一种特殊的prime editing guide RNA（pegRNA）来实现基因编辑。
- ● 特点：可修复多种复杂突变，但编辑效率较低，载体设计复杂。
- ● 适用类型：复杂突变，以及突变位点附近无法找到合适的gRNA序列。
三、单碱基编辑器
- ● 将碱基脱氨酶与CRISPR/Cas系统整合开发出的单碱基编辑系统，可在不切断DNA双链的情况下精准引入C/G-T/A及A/T-G/C点突变，从而实现高效精准的基因编辑。
- ● 特点：高效，但符合要求的需求较少。
- ● 适用类型：满足特定单碱基变换（C⇌T；A⇌G），且只有目标位点在活性窗口内。
四、质粒抗性法
- ● Donor用质粒构建，在内含子插入一个抗性基因表达盒，通过药筛提高点突变重组效率。
- ● 特点：适用突变位点附近无法找到合适gRNA序列的需求，费用较高，周期较长。
- ● 适用类型：适用突变位点附近无法找到合适gRNA序列的需求。
3. 点突变细胞系的构建周期一般多久？
在常规CRISPR编辑中，由于HDR效率低，点突变项目通常需10–12周甚至更久。源井生物通过自主研发的EZ-HRex™系统， 有效提升同源定向修复（HDR）效率，缩短实验周期。在此平台支持下，我们可在 6–8周内交付经过验证的阳性突变克隆， 大大加快项目进度，助力科研更高效推进。
4. 为什么要选择源井生物基因点突变服务？
在精准基因编辑领域， 效率与准确性 决定研究进度和结果的可控性。源井生物凭借多年深耕CRISPR技术，基于自主研发的 CRISPR-U™ 平台 ，创新推出新一代编辑系统 —— EZ-HRex™ 技术 ，在点突变及片段敲入中实现了效率与稳定性的飞跃。
EZ-HRex™ 技术升级，成就更高HDR效率；
通过整合自主研发的 U+调控分子 ，EZ-HRex™ 技术实现两大突破：
- ● 调节细胞周期： 有效促进更多细胞在转染后进入 S/G2期 ，显著提升HDR活性窗口；
- ● 抑制NHEJ通路： 降低非同源末端连接（NHEJ）活性，减少随机 indel， 提高目标突变的精确性和纯度。
实验数据显示， 转染后Cell Pool水平的 HDR基因型占比高达84% ，大幅优于传统方法。
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