精准点突变细胞系构建 — 四大方案详解

精准点突变细胞系构建 — 四大方案详解 | 源井生物为SNP研究保驾护航

随着高通量测序（NGS）技术的飞速发展，越来越多的人类单核苷酸多态性（SNP）与疾病发生密切相关。为了深入研究这些SNP相关疾病的发病机制及潜在治疗策略，构建具有特定位点突变的细胞模型成为基础研究的重要手段。 然而，点突变细胞系的构建技术门槛高、效率波动大，选择合适的策略往往可以起到事半功倍的效果。Ubigene生物基于多年基因编辑经验，提供四种高效策略，全面覆盖不同科研需求。点击了解详情>>

主流选择，流程灵活，适合多数贴壁细胞及常见SNP构建需求。

原理解析

将体外合成的gRNA与Cas9蛋白形成RNP复合物，并与单链寡核苷酸（ssODN）供体模板共转染入细胞。Cas9识别并切割目标位点，细胞利用ssODN通过HDR机制修复，完成碱基替换。

实验流程

1.设计高特异性gRNA：靶向突变点±20 bp区域

2.合成ssODN供体模板（约120–150nt）

3.RNP复合物与ssODN共转染（电转/脂质体）

4.PCR初筛 + Sanger测序验证

✅ 优势

1.无需DNA质粒载体，瞬时表达，脱靶风险低

2.流程简洁，适用于多数细胞类型

3.sgRNA设计灵活，成本较低

局限性

1.RNA易降解，对操作要求较高

2.依赖靶点附近可设计有效gRNA，否则效率低

3.不适用于难转染细胞或低HDR背景细胞

新一代CRISPR衍生工具，无需双链断裂或供体模板，可实现碱基转换、插入、缺失等复杂编辑

原理解析

Prime Editing使用融合蛋白 Prime Editor（Cas9-nickase + 逆转录酶）与特殊pegRNA，通过引导逆转录反应，将包含突变信息的“模板”直接写入DNA中，精准完成碱基替换或小片段变异。

实验流程

1.设计pegRNA（含引导序列、逆转录模板、PBS区）

2.共转染Prime Editor表达载体 + pegRNA表达载体

3.通常采用质粒转染（电转/脂质体）

4.通过测序进行筛选和验证

✅ 优势

1.可实现所有类型点突变，包括非转换型突变（如C→G、A→T）

2.不依赖双链断裂，减少indel与脱靶事件

3.灵活度高，适用于突变修复、功能验证

局限性

1.技术门槛较高，pegRNA设计复杂

2.编辑效率整体低于碱基编辑

3.编辑效率对目标序列结构敏感

4.尚不适用于所有细胞类型（部分细胞转染效率低）

无断裂、无供体、效率极高，适合特定类型碱基替换

原理解析

利用融合脱氨酶（如APOBEC或TadA）与Cas9-nickase的碱基编辑器系统，实现靶向位点特定碱基直接转化，无需双链断裂或HDR参与：

· CBE：C→T / G→A

· ABE：A→G / T→C

实验流程

1.设计gRNA（使目标突变位于编辑窗口内）

2.转染碱基编辑系统（质粒或病毒）

3.通常采用脂质体、电转等转染方式

4.PCR初筛后，需测序确认编辑成功与否

✅ 优势

1.编辑效率极高，无DSB引起的细胞毒性或indel问题

2.对编辑安全性要求高的场景尤为适用（如突变校正）

3.在动植物细胞中均已广泛验证

局限性

1.编辑碱基类型受限，仅适用于特定转换型突变

2.编辑窗口较小，存在“旁观突变”风险

3.不能编辑存在多个同碱基的窗口位点

适用于无法通过RNP或BE设计gRNA的复杂突变位点

原理解析

利用表达gRNA和Cas9的质粒 + 携带同源臂和抗性基因盒的供体质粒，实现HDR。供体中抗性基因通常嵌入内含子，由LoxP位点包裹，后期可通过Cre去除。通过抗生素筛选，大幅提升阳性克隆概率。

实验流程

1.在目标基因内含子区域设计gRNA，设计左右同源臂（600–1000bp）

2.共转染gRNA/Cas9质粒 + Donor质粒

3.抗生素筛选阳性克隆，再转染Cre表达质粒去除抗性盒

4.PCR初筛 + 测序验证

✅ 优势

1.筛选效率高，适用于低HDR背景细胞

2.不依赖近端PAM位点设计，gRNA更灵活

3.可构建复杂/低频点突变模型

局限性

1.实验周期长，操作流程复杂

2.抗性盒移除后仍残留LoxP痕迹

3.不适用于不耐受抗生素的细胞系

Ubigene基于CRISPR-U™平台，升级开发出具有自主知识产权的EZ-HRex™技术，通过创新引入U+小分子调控因子，抑制NHEJ途径，增强HDR修复效率，广泛适用于点突变及片段敲入模型构建。

· HDR效率在多数细胞中 提升至高达84%+

· 适配所有四种构建方法

· 显著降低背景indel，提升克隆纯度

· 适合大规模突变模型构建/药筛/功能验证平台

源井EZ-HRex™新技术

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方法	是否DSB	是否供体	是否需筛选	可编辑类型	编辑效率	优势特点
RNP法	✅ 是	✅ ssODN	否	简单替换	★★★★☆	灵活、快速、低毒性
Prime Editing	❌ 否	❌ 无	否	插入、删除、任意突变	★★☆☆☆	精准广谱，技术新
Base Editing	❌ 否	❌ 无	否	A↔G, C↔T型	★★★★★	无断裂，效率最高
质粒抗性法	✅ 是	✅ 质粒	✅ 抗生素筛选	难构建突变	★★★★☆	筛选增强，适用复杂设计

应用建议

应用类型	推荐方案
常规点突变（如SNP）	RNP 或 Base Editing
碱基替换无法覆盖的突变（如插入/删除）	Prime Editing
靶点无合适gRNA或效率低	抗性筛选法
难转染/低HDR细胞（如悬浮系）	搭配AAV或EZ-HRex系统

300+成功案例，四大技术路径，全面覆盖多类型突变需求

· 丰富经验：已成功构建 300余种点突变细胞模型，涵盖常见肿瘤相关突变、药物靶点突变、遗传病模型等

· 技术多元：整合 RNP法、Prime Editing、Base Editing、质粒抗性法 四大策略，灵活应对不同类型点突变（碱基转换、插入、删除、非标准替换等）

· 模型覆盖广泛：适用于贴壁系、悬浮系、干细胞、癌细胞等多种细胞类型

· 高效率高纯度：结合Ubigene专有 EZ-HRex™ HDR增强系统，大幅提升编辑效率与克隆效率

无论是精准替换、复杂突变，还是低编辑背景细胞，源井生物都能为您量身定制最优策略。

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