正交CRISPR文库筛选联合单细胞测序在免疫研究的应用

正交CRISPR文库筛选联合单细胞测序在免疫研究的应用

正交实验是一种多因素多水平的实验设计方法，它可以有效减少实验次数，在少量实验中获取足够信息。联合目前最热的靶点筛选工具——CRISPR文库和单细胞测序技术，可以检测出细胞之间的差异信息，寻找潜在的疾病治疗靶点。

今天小源给大家分享一篇美国杜克大学Charles A. Gersbach团队在Nature Genetics（IF=31）上发表的文章：Transcriptional and epigenetic regulators of human CD8+ T cell function identified through orthogonal CRISPR screens，该文章开发了一种池化的表观遗传CRISPR筛选方法，系统地评估了120个转录和表观遗传调节因子对人类CD8+ T细胞状态的激活或抑制作用。

连续性T细胞疗法（ACT）通过表达识别并结合肿瘤相关抗原的工程化受体将T细胞重定向至癌细胞，从而具有巨大的癌症治疗潜力。T细胞的状态和功能在很大程度上受特异性转录因子（TF）和表观遗传修饰剂的调节，这些转录因子和表观遗传修饰剂将内在和外在信号处理成复杂且精细调节的基因表达程序。在这篇文章中，作者开发了一种在原代人类T细胞中进行干扰（CRISPRi）或激活（CRISPRa）筛选的方法，并将其应用于系统地分析120个基因对人类CD8+ T细胞状态的影响。这些筛选和随后的表征揭示了过表达BATF3支持记忆T细胞的特定特征，对抗T细胞耗竭并改善肿瘤控制。

作者设计了一个靶向120个与T细胞状态相关的转录因子和表观遗传修饰物的gRNA文库。CCR7是一种充分表征的T细胞标志物，并且在特定T细胞亚群中高度表达（图1）。为了检测特定基因扰动是否改变了T细胞状态，作者使用CCR7表达作为筛选读数。

图1 CRISPR干扰或激活基因筛选可识别人类CD 8 +T细胞状态的转录和表观遗传调节因子

靶向BATF和BATF3的多个gRNA在CRISPRi和CRISPRa筛选中以相互方向富集，并且BATF和BATF3是基因水平分析中最重要的命中点之一，这凸显了耦合功能缺失或获得扰动的功效。联合单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析作者的CRISPRi或CRISPRa筛选中鉴定的每个候选基因的转录组学效应（图2-3）。分析显示BATF3的gRNA在CRISPRa中扰动作用是最强的，BATF3诱导的基因富集在DNA和信使RNA代谢过程，核糖体生物发生和细胞周期通路，表明BATF3改善了T细胞适应性。

图2 CRISPRi和CRISPRa筛选的CCR 7 HIGH和CCR 7 LOW群体之间gRNA丰度变化

图3 CRISPRi和CRISPRa的每种gRNA的CCR7表达与对照细胞相比的平均倍数变化

BATF 3可促进小鼠CD 8+ T细胞的存活和记忆形成。考虑到BATF 3 ORF递送导致BATF 3表达高于内源性BATF 3激活，作者使用异位BATF 3表达进行所有后续试验。在原位人HER 2+乳腺癌模型中，与对照CAR T细胞相比，共表达BATF 3的CAR T细胞显著降低肿瘤活性（图4）。此外，为去除其他转录因子的影响进一步放大BATF3 OE的作用，作者构建靶向敲除所有人类TF基因的gRNA文库同时过表达BATF3/mCherry（图5）。作者在有/无BATF3 OE的情况下对所有人转录因子基因进行了合并的CRISPR-KO筛选，使用正交筛选的方式将 TF OE与TFome KO筛选相结合以剖析辅因子和下游因子，这一筛选系统可以作为设计下一代癌症免疫疗法的基础，有望在未来为癌症治疗带来更好的效果。

图4 BATF3 OE增强CAR T细胞效力

图5 CRISPR KO筛选BATF3的辅助因子和癌症免疫治疗靶点

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参考文献：

McCutcheon S R, Swartz A M, Brown M C, et al. Transcriptional and epigenetic regulators of human CD8+ T cell function identified through orthogonal CRISPR screens[J]. Nature Genetics, 2023, 55(12): 2211-2223.