CRISPR文库|解锁乳腺癌靶点筛选新思路

CRISPR文库|解锁乳腺癌靶点筛选新思路

乳腺癌简介

乳腺癌是女性最常诊断出的恶性肿瘤，也是全球女性癌症死亡的第二大原因，其研究和治疗进展一直是医学界关注的焦点^[1]。根据肿瘤组织中受体分子的表达状态，乳腺癌可以分为：Luminal A型、Luminal B型、HER-2过表达型和三阴性乳腺癌^[2]。其中，三阴性乳腺癌不表达常规的激素受体和HER-2，这使得传统的内分泌治疗和HER-2靶向治疗在这类患者中效果有限^[3]。因此，需要更加深入研究乳腺癌，开发新型的治疗手段，为乳腺癌患者提供了新的治疗选择和希望。

图1 乳腺癌亚型及占比^[2]

随着基因编辑技术的飞速发展，CRISPR-Cas9系统以其卓越的精确性和灵活性，为癌症研究领域带来了革命性的变化。而CRISPR文库作为该技术的一种应用，通过大规模筛选基因功能，为乳腺癌的研究提供了强大的工具。跟随小源一起探索CRISPR文库筛选如何助力乳腺癌研究，我们可能会收获新的思路和见解，从而更加有效地应用这个强大的工具！

乳腺癌耐药新靶点的发现-NUMEN

BRCA1基因是与遗传性乳腺癌高度相关的肿瘤抑制基因，其功能丧失会导致DNA双链断裂修复缺陷，使得细胞对PARP抑制剂（PARPi）特别敏感，但是发现肿瘤细胞可能对PARPi耐药^[4]。Chen Bohong等人^[5]通过全基因组CRISPR文库筛选发现了NUMEN这一基因，它在BRCA1缺失的乳腺癌细胞中对PARPi的抗性至关重要。NUMEN通过其结构特异性的核酸酶活性，促进了非同源末端连接（NHEJ）依赖的DNA双链断裂修复。这项研究不仅揭示了NUMEN在DNA修复和基因组稳定性维持中的作用，还为开发针对PARPi耐药乳腺癌的新型治疗策略提供了可能的靶点。

文库类型：全基因组敲除CRISPR文库（GeCKOv2 库）

转导细胞：可诱导表达CAs9的BRCA1^−/−基因敲除MDA-MB-231细胞

筛选思路：体外加药筛选

筛选方法：在含有多西环素（doxycycline）的条件下培养细胞，以诱导Cas9的表达，然后加入PARP抑制剂奥拉帕尼（olaparib）进行筛选。

图2 全基因组CRISPR筛选流程^[5]

三阴性乳腺癌靶点的发现-Cop1

三阴性乳腺癌（TNBC）是一种预后较差的癌症类型，对免疫检查点阻断（ICB）治疗的反应有限。而肿瘤微环境（TME）中的免疫细胞，特别是肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），在促进肿瘤生长和转移中起着重要作用。Wang Xiaoqing等人^[6]通过两轮CRISPR文库筛选，最终鉴定出E3泛素连接酶Cop1是一个重要的调节巨噬细胞浸润和抗PD-1反应的基因。Cop1的敲除可以减少肿瘤相关巨噬细胞的浸润，增强抗肿瘤免疫反应，并提高对ICB治疗的反应。通过抑制Cop1可以改善TNBC的癌症免疫治疗疗效，这为开发新的癌症治疗策略提供了潜在的靶点。

文库类型：基因敲除亚文库MusCK 1.0，基因敲除亚文库MusCK 2.0

靶向基因：MusCK 1.0：4500多个与肿瘤起始、进展和免疫调节相关基因；MusCK 2.0：在第一次文库筛选中确定的79个候选基因。

转导细胞：表达卵清蛋白（mOva）的4T1细胞

筛选思路：小鼠体内筛选，二次筛选。

筛选方法：为了模拟不同的免疫微环境，研究者使用了不同免疫状态下的小鼠，包括Foxn1^nu/nu小鼠（免疫缺陷）、野生型小鼠（免疫能力正常）、接种了卵清蛋白（OVA）疫苗的小鼠。将转导后的4T1细胞注射到小鼠的乳房脂肪垫内，在肿瘤植入后的一定时间点，收集肿瘤组织。根据第一次筛选测序分析获得的79个候选基因再次构建sgRNA库，方法与第一次筛选类似并新增了接种OVA疫苗且接受PD-1阻断治疗的小鼠组。

图3 第一次体内筛选流程^[6]

图4 第二次体内筛选流程^[6]

乳腺癌风险基因识别新平台—CRISPR文库

Natasha K. Tuano等人^[7]通过全基因组关联分析（GWAS）发现200多个与乳腺癌风险相关的基因，大多数候选致病突变位于非编码区，这些突变位点通过调控基因表达影响癌症表型。然而，精确定位靶基因并识别其表型是艰巨任务。为了克服这一挑战，他们进一步通过60个CRISPR文库筛选，最终鉴定出了20个高置信度的基因。这些基因通过促进乳腺细胞的增殖或调节DNA损伤响应来促进癌症的发生与进展。这一研究不仅展示了CRISPR文库筛选在准确识别风险位点基因靶点方面的能力，还证明了其高效性，为识别和增加乳腺癌风险相关的基因靶点提供了一个重要的平台。

文库类型：敲除文库、抑制文库以及激活文库。

靶向基因：由全基因组关联分析（GWAS）识别出的200多个与乳腺癌风险相关的位点基因。

转导细胞：六种不同乳腺细胞系，包括K5+/K19+、K5+/K19-、B80-T17、mesHMLE、B80-T5、HMLE

筛选思路：体外表型筛选，小鼠体内筛选，体外加药合成致死筛选

筛选方法：2D和3D细胞增殖筛选：在二维（2D）和三维（3D）培养条件下评估细胞的增殖能力，以模拟细胞在体内生长的情况。

        体内筛选：将经过细胞注射到免疫缺陷的小鼠中，观察肿瘤形成情况。

        DNA损伤响应筛选：使用PARP抑制剂奥拉帕尼（olaparib）处理细胞，筛选对DNA损伤响应有影响的基因。

图5 CRISPR文库筛选确定了在2D、3D细胞培养模型中调节增殖的乳腺癌风险基因^[7]

图6 CRISPR激活和抑制筛选确定调节小鼠肿瘤生长的乳腺癌风险基因^[7]

图7 Olaparib合成致死筛选识别调节DNA修复途径的乳腺癌风险基因^[7]

小结

看完以上三个应用实例，我们不难发现，CRISPR文库在乳腺癌研究中具有多样性和灵活性。比如，在靶基因的选择上，不仅可以选择全基因组筛查，还可以选择其他方法筛选得到的大量基因。在细胞类型上，不仅可以使用野生型细胞，还可以选择基因编辑修饰的细胞以模拟特定基因突变的影响。在筛选方法上，可以是体外筛选，也可以是体内筛选，甚至可以采用体内和体外相互结合的筛选策略，以提高筛选的准确性和有效性。

总之，CRISPR文库技术为乳腺癌研究提供了个性化的、灵活的解决方案。根据具体的研究目标，可以对CRISPR文库进行个性化的调整和优化，从而筛选出置信度高的靶点，为乳腺癌的治疗开辟新的道路。

参考文献：

[1] https://www.who.int/zh/news-room/fact-sheets/detail/breast-cancer

[2] Nolan, E., Lindeman, G. J., & Visvader, J. E. (2023). Deciphering breast cancer: from biology to the clinic. Cell, 186(8), 1708–1728.

[3] Leon-Ferre, R. A., & Goetz, M. P. (2023). Advances in systemic therapies for triple negative breast cancer. BMJ (Clinical research ed.), 381, e071674.

[4] Geyer CE Jr, Garber JE, Gelber RD, et al. Overall survival in the OlympiA phase III trial of adjuvant olaparib in patients with germline pathogenic variants in BRCA1/2 and high-risk, early breast cancer. Ann Oncol. 2022;33(12):1250-1268.

[5] Chen, Bohong et al. Transmembrane nuclease NUMEN/ENDOD1 regulates DNA repair pathway choice at the nuclear periphery. Nature cell biology vol. 25,7 (2023): 1004-1016.

[6] Wang, Xiaoqing et al. “In vivo CRISPR screens identify the E3 ligase Cop1 as a modulator of macrophage infiltration and cancer immunotherapy target.” Cell vol. 184,21 (2021): 5357-5374.e22.

[7] Tuano NK, Beesley J, Manning M, et al. CRISPR screens identify gene targets at breast cancer risk loci. Genome Biol. 2023;24(1):59. Published 2023 Mar 29.