干货系列|Hep G2细胞基因编辑实战技巧

干货系列|Hep G2细胞基因编辑实战技巧

今天是第3期细胞培养干货-Hep G2，本期介绍Hep G2细胞培养和基因编辑的实战技巧。

HepG2细胞是一种人源肝癌细胞系，来源于一名患有肝细胞癌的15岁白人男性的肝组织。这一细胞系具有广泛的应用价值，可用于肝母细胞瘤和肝细胞癌体外模型的建立、肝脏药物代谢途径研究以及肝炎病毒感染模型的构建等。此外，经过基因编辑改造的Hep G2细胞系也是肝癌发病机制、耐药机制和癌症治疗等领域的重要工具。

然而，要确保Hep G2细胞的稳定性和实验结果的可靠性，掌握良好的细胞培养技巧尤为重要。现在让小源带大家一起来了解如何培养好Hep G2细胞吧。

首先，先了解一下Hep G2的基本信息。

图1 生长正常的Hep G2细胞（左：汇合度高；右：汇合度低）

细胞培养步骤

细胞复苏

1) 准备工作：准备好所要复苏的细胞；预热水浴锅至37℃；预热完全培养基

2) 超净台内吸取7 mL已预热好的完全培养基至15 mL离心管备用

3) 将细胞从干冰里取出，用镊子夹住盖子放入37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化

4) 用单道移液器将细胞悬液转至步骤2）提前准备好的15ml离心管中，1100 rpm室温离心 4 分钟

5) 同时准备一个新的T25培养瓶，加入4mL完全培养基

6) 离心结束，弃去上清，加入1mL新鲜完全培养基重悬细胞后加入步骤5）的培养瓶里，放入培养箱

7) 第二天观察细胞状态及贴壁情况。

细胞传代（以T25瓶为例）

1) 当细胞汇合度达到80%-90%时可进行传代，传代时在超净台内弃去培养瓶里的培养液，加入5mLPBS洗涤细胞1-2次

2) 加入1mL胰酶，轻轻晃动瓶子并使胰酶完全浸过细胞，将培养瓶放入培养箱孵育1-3分钟，待在显微镜下观察到大部分细胞变圆不贴壁，轻轻晃动培养瓶两侧有大部分细胞脱离时，立即终止消化

3) 加入2倍胰酶体积即2mL完全培养基终止消化，然后转移至15mL离心管中

4) 1100 rpm 室温离心 4 分钟，离心结束，弃去上清，加入培养基重悬细胞

5) 细胞按照1:2-1:4比例传代，传代第二天观察细胞状态

注意事项：
1.Hep G2细胞呈块状生长。细胞传代消化一定要完全，轻拍培养瓶至细胞团块完全脱落可进行终止消化，消化不完全的话，细胞容易聚集成团

2. 重悬吹打细胞时尽量把细胞吹散，吹成单细胞，但要注意吹打力度需适中温柔，不可大力吹打，避免对细胞造成损伤

3. 细胞对培养条件严格，特别是对血清敏感，需要选择高质量胎牛血清进行培养

4. 由于细胞会呈团块生长，复苏后细胞形态可能会与正常细胞形态存在差异，这是正常的，经过几次传代后细胞形态会恢复正常

5. 细胞培养过程中会出现少量空泡，这是正常现象

细胞冻存：

1) 按细胞传代的方法，在超净台内把培养瓶里的细胞进行消化至单细胞悬液，所有液体转移到离心管中

2) 用移液管吹打混合均匀，取20 μL进行细胞计数

3) 1100 rpm室温离心4分钟，离心结束弃去上清，用1~2 mL 4℃预冷的冻存液重悬细胞，随后加入冻存液调整至密度为1*10^6个细胞/mL

4) 将细胞悬液按1 mL/管平均分装至提前贴好标签的冻存管中

5) 将冻存管放置于4℃预冷的程序降温盒中，并在冻存结束的15分钟之内将程序降温盒放置超低温冰箱；

6) 过夜后，将冻存细胞转移至液氮罐内保存

FAQs

如何避免细胞复苏存活率低？

1. 复苏时要做到快且稳

2. 复苏后培养条件选择正确，选择正确的培养基、血清、温度、二氧化碳浓度等，避免过度振动培养皿，减少对细胞的机械损伤

3. 复苏时可先接种至小培养皿培养，待小培养皿长满后再进行扩增

4. 冻存前要确保细胞处于良好的生长状态

5. 可在冻存前消化终止离心结束后用PBS洗涤细胞两次后再加冻存液重悬细胞

6. 可适当提高冻存密度

细胞状态差如何调整？

图2  状态差的Hep G2细胞

1. 培养基和血清：确保使用正确的基础培养基和加入适量血清；Hep G2细胞可提高血清浓度进行培养

2. 细胞培养环境：确认培养温度、湿度、气相条件是否正常

3. 细胞传代、换液操作：细胞传代时，注意消化时间和胰酶浓度，避免因消化时间过长或过短导致的细胞损伤；一般2～3天进行一次换液，避免长时间不进行换液处理

4. 细胞复苏及冻存：确保细胞复苏和冻存操作规范，以减少细胞损伤和死亡

5. 若细胞密度低，可提高细胞密度至70%以上，细胞密度大，细胞分泌的细胞因子多，有利于细胞增殖。

细胞表面存在死细胞如何处理？

1. 用PBS摇晃清洗两次，然后加入胰酶进行摇晃润洗，待观察到表面的死细胞有要飘起来的迹象时，快速弃掉胰酶

2. 再次加入PBS清洗细胞，然后加入胰酶正常消化

3. 可在消化终止离心结束后加入PBS重悬再洗细胞一次

基因编辑小Tips

Hep G2细胞如何提高转染效率？

1.确保细胞状态良好，细胞处于对数生长期，细胞密度适中

2.注意细胞消化时间，避免过度消化，对细胞造成伤害

3.细胞进行实验时建议活率＞80%

4.实验过程中细胞要吹打成单细胞，避免细胞聚团

5.使用不同转染方法，要注意的细节也有所不同，小源列举了常用的电转法和慢病毒法。

Hep G2细胞如何提高单克隆形成率？

1.细胞铺克隆时活率需要＞80%

2.铺克隆时选择使用优质胎牛血清

3.铺克隆可用PBS清洗1次

图5 Hep G2单克隆

又是干货满满的一天，希望这些干货分享能让大家对培养和转染Hep G2细胞更加充满信心！源井的Hep G2细胞系经过上百例基因编辑实验优选，现在野生型细胞＋专用完全培养基套餐低至980元！我们还可提供基因编辑技术服务，想要轻松获得优质的Hep G2细胞可以联系小源，现有300+热门基因KO细胞低至￥4980（包含肝癌领域）~