基因敲入细胞

基因敲入细胞系的构建主要依赖CRISPR/Cas9介导的同源定向修复（HDR）或非同源末端连接（NHEJ）机制，可实现外源基因、标签或突变片段的精准插入。随着Prime Editing和重组酶系统（如Cre-LoxP）的发展，研究者可根据不同应用选择最合适的敲入策略。源井生物自主开发的EZ-HRex™平台在调控细胞周期、抑制NHEJ通路方面具有独特优势，显著提升HDR效率，助力高效构建高保真敲入细胞模型。

基因敲入细胞系的原理，是通过基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）在基因组特定位点产生DNA双链断裂（DSB），并引入一个含有目标插入片段和同源臂（homology arms）的供体DNA模板。细胞利用自身的同源定向修复（HDR）机制，在修复断裂时精确插入目标序列，从而在基因组中实现稳定敲入。该方法可用于插入报告基因、标签序列（如GFP、FLAG），广泛应用于功能研究、化合物筛选和疾病模型构建等领域。

1) 靶点设计与供体构建

• a) 设计CRISPR/Cas9系统中的gRNA，引导Cas9在目标位点切割DNA
• b) 构建供体DNA模板，通常包含：
  • i) 左右同源臂（一般为500–1000 bp）
  • ii) 插入片段（如标签、报告基因、突变位点）

2) 细胞转染（或转导）

• a) 将Cas9/gRNA表达载体或RNP复合物，与供体DNA一起导入细胞
• b) 常用方法包括电转、电穿孔、脂质体转染或病毒转导（如AAV）

3) 同源定向修复（HDR）介导插入

• a) 细胞在S/G2期通过HDR机制修复Cas9切口，整合供体片段
• b) 可配合使用源井CRISPR-U™技术提升HDR效率（如调控细胞周期、抑制NHEJ）

4) 筛选与克隆化培养

• a) 使用抗性筛选（如抗生素）或荧光标记富集阳性细胞
• b) 单细胞克隆培养，获得稳定表达的阳性克隆

5) 基因型验证

• a) 采用PCR、Sanger测序等手段确认插入的正确性与表达情况
• b) 可选NGS检测排查脱靶风险

敲入的基因在正确构建后通常是稳定的，尤其是在经过筛选和验证的单克隆细胞系中。

• 1) 整合于基因组中：
  敲入片段通过同源定向修复（HDR）被精准整合进基因组特定位点（如外显子、启动子或安全位点），在无外源选择压的情况下仍可稳定传代表达。
• 2) 经过单克隆筛选：
  项目中会进行单细胞克隆化培养和扩增，排除混杂群体，确保每株细胞都来自同一稳定整合事件。
• 3) 遗传稳定性验证：
  优质服务通常会提供多代培养后的验证数据（如qPCR、测序），确认基因敲入后在细胞传代过程中的持续表达和位点稳定性。

源井生物依托自主研发的CRISPR-U™平台，在基因敲入服务中具备显著优势：

• ● 更高编辑效率：通过调控细胞周期、抑制NHEJ途径，基因编辑效率可提升10–20倍，显著提高同源重组（HDR）成功率；
• ● 更强项目经验：已在300+种不同细胞类型中成功完成6000+次基因编辑项目，涵盖科研、药物开发等多领域；
• ● 更快交付周期：优化流程支持在6–8周内交付阳性克隆，助力项目快速推进；
• ● 严谨质控体系：每个项目均配套Sanger测序验证，确保插入正确、表达稳定

无论是构建标签蛋白、插入报告系统，还是疾病突变模拟，源井生物都能为您提供高效率、高准确性、高稳定性的一站式基因敲入解决方案。