报告基因敲入（KI）细胞系的构建原理与应用前景：从机制到实践

报告基因敲入（KI）细胞系的构建原理与应用前景：从机制到实践

CRISPR-Cas9系统作为第三代基因编辑技术的代表性平台，因其高度的靶向特异性、可编程性以及操作简便性，在基础科研和临床转化研究中得到广泛应用。该系统源自原核生物的获得性免疫机制，核心组成包括Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）。Cas9在gRNA的引导下识别靶向DNA序列并切割目标位点，造成DNA双链断裂（Double-Strand Break, DSB）。在此基础上，细胞可通过以下两种内源修复途径完成DSB修复：

· 非同源末端连接（Non-Homologous End Joining, NHEJ）：该机制快速但易出错，常伴随小片段缺失或插入，从而导致基因功能丧失，适用于基因敲除（knock-out）

· 同源重组修复（Homology-Directed Repair, HDR）：在提供供体模板（含同源臂及目标插入序列）前提下，细胞可通过HDR机制实现精确的外源序列插入，用于构建基因敲入（knock-in, KI）模型。

借助CRISPR-Cas9系统，研究者可高效构建包含报告基因的精准KI细胞系。该类细胞模型作为CRISPR技术在细胞工程中的典型应用之一，凭借其内源性表达可视化、动态可追踪和高通量筛选等优势，已成为分子机制研究、药物开发和功能基因组学的核心工具。本文将围绕报告基因KI细胞系的构建原理、技术策略与应用前景展开系统介绍，旨在为相关科研人员提供前沿的研究思路与技术参考。

敲入是指将目的序列（如荧光报告基因）插入至特定的基因组位点，使其在内源性启动子的调控下稳定表达。与传统的质粒过表达系统相比，KI细胞系具备以下关键优势：

· 表达水平生理相关性高；

· 可进行动态、定量与定位分析；

· 消除启动子泄漏与随机整合问题。

在CRISPR辅助下，KI操作的效率与稳定性得到了革命性的提升，推动了细胞功能研究的精确化与规模化。

1. 报告基因定义

报告基因是指通过其产物的易检测性，用于反映目标基因转录或翻译状态的外源序列，常用于构建基因表达、蛋白定位或信号通路活性监测系统。

常见类型包括：

2. 报告细胞系定义

报告细胞系是指在目标位点通过敲入方式稳定表达报告基因的细胞模型。其表达受内源启动子调控，可精确反映内源基因的时空表达规律，是细胞水平功能研究、机制探究和药物筛选的核心工具。

为实现高保真度的基因表达与功能再现，报告基因的插入策略至关重要。以下为当前主流的KI构建方式：

1. 启动子下游插入（Promoter-proximal tagging）

将报告基因插入至目标基因的起始密码子前或起始内含子中，在不干扰其调控元件的基础上实现标签表达。

特点：最大程度保留内源表达调控机制，适用于转录活性分析。

2. 编码区融合（In-frame fusion）

将报告基因与目标基因5'或3'端融合表达，形成功能性融合蛋白。

特点：适合亚细胞定位、动态转运分析。

3. IRES/2A共表达系统

通过内部核糖体进入位点（IRES）或2A肽连接目标蛋白与报告基因，实现转录共表达但翻译产物分离。

特点：不干扰目标蛋白结构，适用于功能保留要求高的实验。

4. 替换表达（Knock-in replacement）

完全替换内源编码区，报告基因由原启动子驱动表达。

特点：适合在目标基因功能已知或需打断其表达时使用，如基因功能剔除与替代。

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图1: 报告基因敲入的常见策略

1. 内源启动子活性监测与基因调控机制研究

报告基因敲入技术使得在天然染色质背景下监测特定基因启动子的活性成为可能，突破了传统外源质粒系统带来的表达背景干扰问题。通过将报告基因（如EGFP或荧光素酶）精确整合至目标基因的转录起始位点下游，研究人员可实现对启动子活性的实时监测，尤其适用于研究转录因子调控、表观遗传修饰及非编码调控元件等对基因表达的影响。

例如，在SREBP1基因的研究中，研究人员通过CRISPR/Cas9将荧光素酶基因敲入SREBP1位点，构建了HEK293-SREBP1-T2A-luciferase报告细胞系。一等位基因精确整合荧光素酶，而另一等位基因通过14 bp缺失实现功能敲除。该细胞系中，荧光素酶的活性高度对应于SREBP1启动子的内源活性，成为转录水平动态监测的重要工具。

优势：

· 精确反映内源基因调控状态

· 适用于启动子突变分析、转录因子筛选、信号通路活性检测等

· 可实现药物或外界刺激下的启动子响应动力学研究

2. 蛋白质表达、定位及亚细胞转运动态追踪

将荧光标签（如GFP、mCherry）融合至目标蛋白的N端或C端位点，是研究蛋白功能的经典策略。通过CRISPR/Cas9将标签基因无缝敲入内源基因座，构建的融合蛋白不仅保留原始表达调控，还可进行实时成像、表达水平定量、细胞器定位及动态转运分析。

以GFP-LC3报告细胞为例，研究人员在293FT细胞中将绿色荧光蛋白（GFP）敲入内源MAP1LC3B基因座的N端，获得由天然启动子驱动表达的GFP-LC3融合蛋白。该系统广泛用于细胞自噬研究，能够精准区分游离型GFP与自噬小体中LC3的状态变化，并在雷帕霉素诱导或CQ抑制处理下表现出显著的信号差异，实现自噬水平的动态评估与定量分析。

优势：

· 无需抗体即可实现蛋白检测和追踪

· 可用于研究蛋白翻译、修饰、复合物形成、降解等过程

· 支持高内涵成像分析和活细胞追踪实验

图2: 293FT细胞中MAP1LC3B基因座处敲入GFP-LC3

3. 候选药物的目标识别和评估

报告基因KI细胞系可作为高灵敏度、低背景噪声的药物筛选平台。将报告基因（如荧光素酶或荧光蛋白）融合至药物靶点基因，通过观察报告信号的变化来监测靶基因表达或功能状态，从而快速筛选作用于该通路的潜在化合物。

例如，研究人员利用三重标记的HELA细胞系（分别标记核蛋白Histone 1-mTagBFP2、细胞骨架β-Tubulin-mClover3、自噬受体SQSTM1-mRuby3），联合荧光共定位与活细胞成像，对激酶抑制剂对自噬通路的影响进行筛选。PLK1抑制剂BI-6727和PIM激酶抑制剂CX-6258均能诱导细胞质中自噬囊泡的显著积累，类似于已知自噬阻断剂羟氯喹的作用，验证了该系统在药效学研究中的实用性。

优势：

· 可用于药物敏感性预测与机制研究

· 实现高通量、自动化的药物初筛

· 能有效规避传统筛选方法中由于表达系统差异导致的假阳性问题

图3: 三重标记的HELA细胞系中诱导自噬囊泡积累的激酶抑制剂的验证

报告基因KI细胞系的广泛应用，标志着分子细胞生物学向精准可视化、动态定量与高通量并行发展的新阶段。这些细胞模型不仅提升了基因功能解析的深度与广度，也为药物开发、合成生物学及个体化医疗提供了坚实的技术支撑。

随着CRISPR系统工具的不断迭代，配合单细胞测序、AI辅助药筛、三维类器官等新技术，报告细胞系将逐步成为高阶研究平台，驱动从基础研究到临床转化的快速进程。

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参考文献

[1] Establishment of a HEK293 cell line by CRISPR/Cas9- mediated luciferase knock-in to study transcriptional regulation of the human SREBP1 gene. Biotechnol Lett, 2018, (11-12):1495-1506.
[2] CRISPR/Cas9 mediated GFP knock-in at the MAP1LC3B locus in 293FT cells is better for bona fide monitoring cellular autophagy. Biotechnol J, 2018, 13(11): e1700674.
[3] A Versatile Vector System for the Fast Generation of Knock-in Cell Lines with CRISPR, 2020, doi: https://doi.org/10.1101/2020.02.06.927384