Nature|CRISPR文库前沿应用——脑癌研究

Nature | CRISPR文库前沿应用——脑癌研究

脑癌，尤其是胶质母细胞瘤（GBM），一直是医学领域的棘手难题。目前的靶向治疗和免疫疗法对患者生存率的改善效果有限，迫切需要新疗法。近日，通过高通量筛选发现Gliocidin这一化合物，可以为脑癌治疗带来了新的曙光。它能靶向杀死胶质母细胞瘤细胞，同时对正常细胞的毒性较低，且能穿透血脑屏障。这一研究成果有望为脑癌患者带来新希望，开启脑癌治疗新篇章。

在研究该化合物的作用机制时，作者选用了CRISPR文库锁定关键基因，为什么会选择这个方法而不是组学呢？带着问题，和小源一起来看看这个研究是如何进行的吧~

• 高通量筛选：研究者通过高通量筛选超过200,000种化合物，发现了Gliocidin。
• 基因组CRISPR-Cas9筛选：通过CRISPR-Cas9文库筛选，确定了Gliocidin作用的关键基因。
• 体内外实验：在体外细胞实验和体内动物模型中验证了Gliocidin的效果。

研究人员前期进行了高通量化合物筛选，从已有化学库中鉴定出Gliocidin（N-(pyridin-3-yl)thiophene-2-carboxamide）。在细胞实验中，Gliocidin对原发性GBM细胞具有毒性（IC₅₀约为200nM），但对正常的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）无影响。

Gliocidin杀伤HTS(hGFAP-cre;Nf1–/–;Trp53–/–;Pten+/–)而不影响MEF细胞

转录组分析发现大量非特异性的基因表达变化，无法确定Gliocidin细胞内作用靶点。为深入研究Gliocidin靶点和机制，研究人员通过全基因组CRISPR–Cas9文库筛选的方法来寻找潜在靶点。

转录组学分析无法确定Gliocidin细胞内靶点

CRISPR文库筛选

CRISPR文库：小鼠全基因组CRISPR敲除文库（Brie）
转导细胞：NG2-3112细胞
筛选方式：构建全基因组文库敲除的NG2-3112细胞系。将NG2-3112文库细胞分为DMSO和不同浓度的gliocidin处理组（IC50和IC80），并在给药后第0天（收集了2.274×10^8个细胞）和14天收集细胞（7.7441×10^8个细胞），确保每组收集的细胞实现1000X覆盖率。提取基因组DNA，扩增sgRNA构建测序文库，然后使用IlluminaHiSeq平台进行测序。最后，使用MAGeCK-MLE软件包分析测序数据。

CRISPR-Cas9筛选策略

mTORC1的调节作用：通过CRISPR-Cas9筛选发现，Gliocidin处理后，mTORC1活性与对Gliocidin的抗性呈负相关，且与从头嘌呤合成（DNPS）途径酶的富集相关。敲除mTORC1的正调节因子或负调节因子分别导致肿瘤细胞对Gliocidin的敏感性一定程度的降低或增加，抑制mTORC1可减弱Gliocidin诱导的细胞死亡，表明mTORC1虽对Gliocidin有调节作用，但不是其直接靶点。

mTORC1活性与对Gliocidin的抗性呈负相关

mTORC1活性与嘌呤从头合成（DNPS）途径酶正相关

抑制从头鸟嘌呤合成：Gliocidin处理导致复制应激标记物磷酸化CHK1（p-CHK1）水平增加，而mTORC1活性标记物磷酸化S6激酶（p-S6）水平不受影响。补充鸟苷可挽救Gliocidin诱导的细胞死亡，并且这种挽救依赖于嘌呤补救途径。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析表明，Gliocidin处理后，IMPDH2上游的IMP积累，其下游产物鸟嘌呤核苷酸GMP、GDP和GTP减少，表明Gliocidin可能阻碍从头鸟嘌呤核苷酸合成。

NAD⁺salvage途径的参与：CRISPR-Cas9筛选发现，Gliocidin处理细胞后，NAD⁺salvage途径中的基因在富集的sgRNA中排名较高。敲除Nmnat1或Nrk1可使细胞对Gliocidin产生抗性，降低Gliocidin诱导的复制应激、IMP积累和鸟嘌呤核苷酸耗竭。细胞内Gliocidin可转化为Gliocidin-单核苷酸（Gliocidin-MN）、Gliocidin-核糖苷（Gliocidin-R）和Gliocidin-腺嘌呤二核苷酸（GAD），其中GAD是活性代谢物，Nmnat1是其产生的限速酶。

GAD抑制IMPDH2的结构机制：GAD对IMPDH2具有抑制活性，而其他前体（Gliocidin、Gliocidin-R和Gliocidin-MN）无此活性。冷冻电镜结构显示，GAD与IMPDH2的NAD⁺结合口袋结合，阻止NAD⁺与IMPDH2结合，从而抑制IMP向XMP的转化。

GAD与IMPDH2的NAD⁺结合口袋相结合

Gliocidin的体内药代动力学和毒性：Gliocidin具有较强的血脑屏障穿透能力（脑/血浆比=7.75），且在脑实质中的稳定性高于血浆和其他组织。毒性研究显示Gliocidin安全性良好。

Gliocidin血脑屏障穿透能力强，毒性小

单独使用Gliocidin：在免疫功能正常的原位GBM小鼠模型中，Gliocidin单药治疗可延长小鼠生存期。在无胸腺裸鼠的GBM模型中也观察到类似结果，表明T细胞缺失对Gliocidin的治疗效果影响较小。

Gliocidin在GBM小鼠和裸鼠中效果类似

Gliocidin与替莫唑胺联合使用：在原位GBM小鼠模型中，Gliocidin与替莫唑胺联合治疗显著延长了小鼠的生存期，效果优于单独使用Gliocidin或替莫唑胺（图5a,b）。在患者来源的异种移植（PDX）GBM小鼠模型中，联合治疗也能延长生存期，且单细胞RNA测序分析表明，可减少肿瘤细胞毒性，改善生存。

Gliocidin与替莫唑胺联合用药效果更强

Gliocidin作为一种新型的潜在治疗脑肿瘤的化合物，具有诸多优势，如良好的血脑屏障穿透性、较高的脑实质稳定性以及较低的毒性。其通过复杂的细胞内途径发挥作用，最终导致胶质瘤细胞因鸟苷酸耗竭而死亡。NMNAT酶在Gliocidin的抗肿瘤活性中起着关键作用，这提示高表达Nmnat1或Nmnat2的肿瘤可能对Gliocidin治疗更敏感，同时也为联合使用诱导Nmnat表达的药物（如替莫唑胺）提供了理论依据。此外，Gliocidin与免疫疗法的联合应用也具有潜在的研究价值。未来的研究需要进一步探索Gliocidin的耐药机制以及其在其他脑恶性肿瘤中的活性，为脑癌治疗带来更多突破。

Gliocidin在胶质母细胞瘤（GBM）细胞作用机制

CRISPR文库筛选服务快至8周筛到新靶点！还拥有400+CRISPR文库现货产品（质粒、病毒、Cell Pool），欢迎咨询~

参考文献链接：https://doi.org/10.1038/s41586-024-08224-z