答疑贴｜Cell Pool如何传代可保持高覆盖度？

答疑贴｜Cell Pool如何传代可保持高覆盖度？

CRISPR文库筛选的基本原理是：在成功构建含有多种不同基因突变细胞的Cell Pool的基础上，通过对该Cell Pool施加特定的筛选压力（如药物处理、细菌感染、病毒感染等），富集对筛选压力耐受的突变细胞；结合NGS测序和生物信息学分析的方法，获取富集细胞中的sgRNA信息，从而找出与筛选表型相关的靶基因。

在CRISPR文库筛选实验中，构建高质量的Cell Pool是筛选出潜在靶点的关键；然而，由于Cell Pool构建流程繁琐、成本高、周期长等因素，广大有靶点筛选需求的科研群体被“拒之门外”。为了降低大家做文库筛选的门槛，源井生物基于自主研发的CRISPR-iScreen™技术平台，特地推出了CRISPR文库Cell Pool 现货产品，让科研er们低成本、短周期内即可获得想要的Cell Pool细胞，并开展下游筛选实验。目前源井生物的CRISPR文库Cell Pool 现货产品已帮助上百个科研团队找出想要的靶点！

个别客户仍然对文库细胞Cell Pool现货产品是否可用于下游筛选实验存在疑虑，小源在后台也经常收到如文库细胞Cell Pool现货如何保证sgRNA覆盖度、用于下游筛选实验的文库细胞Cell Pool是否应该传代等问题。今天，小源就为大家解答一下这些问题吧！

1. 文库细胞是否可以传代，传代是否会影响细胞中sgRNA覆盖度？

研究表明，当文库细胞感染初始的代表深度较低的情况下（50x），随着细胞代次的增加，sgRNA覆盖度会显著降低；而在保证文库细胞感染初始的代表深度的前提下（>500x），细胞传代至P8，对sgRNA的覆盖度也不会造成明显影响。

图1 文库细胞初始代表深度和传代代次对sgRNA分别的影响

除此之外，sgRNA对基因组进行编辑的机率会随着培养时间的延长而增加，少数sgRNA需在文库细胞培养至第14天时才会对基因组产生显著的编辑效果。文库Cell Pool P0代细胞往往培养时间较短，无法保证绝大多数sgRNA均对基因组产生了良好的基因编辑效果，使用P0代次的细胞进行下游的筛选实验可能会使得这部分尚未产生基因编辑效果的细胞丢失，从而对实验结果造成影响。为了保障文库Cell Pool中绝大多数细胞都被编辑，确保下游筛选结果的可靠性，不建议直接使用P0代细胞进行下游药物筛选实验。

图2 文库细胞中部分sgRNA编辑效率受细胞培养时长的影响

2. 文库细胞冻存后复苏是否会影响覆盖度，文库细胞质量如何保证？

源井生物的CRISPR文库Cell Pool 现货产品均以高代表深度（>500x）进行感染和扩增，并使用高质量无血清冻存液冻存（货号：YK-CR-100）。Cell Pool 现货细胞均经过冻存复苏、传代扩增以及二代测序验证，细胞传代后sgRNA并无显著丢失。有图有真相，小源列举了3个不同的源井生物全基因组文库Cell Pool细胞P0代和P5代的测序结果，如下图所示，P0代细胞复苏并扩增至P5代后，覆盖度并无显著降低，仍可高达99%以上！ 

图3 不同文库细胞在P0代和P5代的测序结果

3. 源井生物CRISPR文库Cell Pool现货细胞是否可用于下游筛选实验？

源井生物CRISPR文库Cell Pool现货细胞在保证细胞sgRNA覆盖度的前提下，适度延长细胞扩增时间；与P0代细胞相比，Cell Pool现货细胞的基因组被编辑概率更高，可直接用于下游药物筛选、流式细胞分选、病毒感染等实验。值得一提的是，少量靶向必需基因的sgRNA会由于对细胞的致死作用，在扩增过程不可避免地丢失；虽然这部分基因并不影响绝大多数的文库细胞筛选实验，但是对于需要通过传代的方式筛选出细胞致死基因的实验则不适用。为了保证筛选结果的可靠性，对于需要使用传代进行文库筛选的实验，建议您使用P0代细胞进行筛选，并且延长文库细胞传代培养时间。

参考文献

[1] Doench JG. Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens. Nat Rev Genet. 2018 Feb;19(2):67-80. doi: 10.1038/nrg.2017.97. Epub 2017 Dec 4.

[2] Shalem O, Sanjana NE, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelson T, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 2014 Jan 3;343(6166):84-87.