一招高效解析基因功能：基因敲除细胞混合克隆（KO Pool）技术

一招高效解析基因功能：基因敲除细胞混合克隆（KO Pool）技术

RISPR/Cas9系统作为一项革命性的基因组编辑技术，已经在基础研究和应用开发中引发巨大变革。尤其在功能基因组学领域，CRISPR技术已逐渐取代传统RNA干扰（RNAi）方法，成为研究基因功能的标准工具之一。其中，基因敲除细胞混合克隆（Knockout Pool, KO pool）策略因其高效、快速、低成本的优势，在高通量筛选和功能验证中显示出广泛的应用前景。

KO pool的优势包括：

1.避免单克隆挑选，显著节省时间和成本

2.敲除效率高，可直接用于功能测定

3.在短时间内获得生物学表型响应

4.在特定应用中可提供比RNAi更彻底、稳定的敲除效果

高质量KO pool适用于多种生物医学研究，特别是在以下方向显示出卓越性能：

1.细胞增殖与存活测定
快速评估基因敲除对细胞生长动力学的影响。

2.功能基因发现与通路解析
高通量筛选关键基因，例如识别癌症驱动因子或疾病易感基因。

3.药物反应性与靶标验证
通过KO pool快速筛查潜在靶标，指导新药开发。

4.疾病模型构建
在原代或诱导多能干细胞中敲除相关基因，模拟疾病状态。

5.抗体验证与蛋白质功能研究
精确定义蛋白敲除状态，验证抗体特异性与下游表型。

源井生物自主研发的CRISPR-U™基因编辑平台，基于CRISPR/Cas9系统，专为细胞系的高效编辑和KO pool构建而优化。该系统融合了多个创新技术模块，包括：

1.靶向设计算法优化：根据细胞系特异的基因组结构与转录图谱，精准设计gRNA，提升打靶效率。

2.双gRNA协同策略：利用两个相邻（40–300 bp）位点的gRNA协同作用，提高双链断裂效率，增强基因敲除彻底性。

3.无偏差检测系统：通过高通量分子组学手段（如qPCR、NGS、MS）准确评估编辑效率与敲除效果。

4.细胞编辑流程标准化：适配数百种常见及难转染细胞系，建立编辑参数数据库，提升编辑效率10–20倍。

5.单细胞微量基因型识别：5.用于下游功能验证或单克隆选育时提供基因型参考。

图1: 定制CRISPR-U™ KO pool的工作流程

源井生物开发的CRISPR-U™优化细胞的基因编辑。其效率和准确性高于传统方法。请立即联系我们了解与您的研究相关的服务吧！

在一项针对HepG2细胞系中吡哆醛激酶（PDXK）基因的研究中，研究团队采用双gRNA协同敲除策略，成功构建了PDXK-KO pool，并与3个独立单克隆PDXK-KO细胞系进行了比较。

蛋白质组学结果显示：

• · KO pool的重复性更高（标准差更低，图1A所示）
• · KO pool中共鉴定出6个显著下调的蛋白质，而单克隆中仅发现4个
• · KO pool更接近群体平均生物学响应，适合早期筛选与系统性评估

注意事项：

尽管KO pool用于短期功能评估非常有效，但在某些情形（如需长期培养、研究单个克隆突变背景）下，仍需构建稳定的单克隆系。此外，必须使用MS等手段确认是否存在截短蛋白或外显子跳跃表达，以避免误判敲除效率。

图2: PDXK-KO细胞的蛋白质组学表型

CRISPR-U™ KO pool技术通过在群体水平高效敲除目标基因，为基因功能探索提供了一个高通量、成本可控、操作简便的新平台。相较RNAi，其在稳定性、特异性和生物学相关性方面均具有显著优势，适用于从早期靶点发现到功能验证的多个研究阶段。如需进一步了解如何将CRISPR-U™ KO pool系统应用于您的科研项目，请即刻联系源井生物，为您的项目提供专属的基因编辑解决方案。

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Reference：

A Tandem Guide RNA-Based Strategy for Efficient CRISPR Gene Editing of Cell Populations with Low Heterogeneity of Edited Alleles. CRISPR J.2020;3(2):123-134.