CRISPR王者时代,RNAi跌落神坛?
shRNA vs gRNA:
比较两种技术,可看出CRISPR技术的优越性:
RNAi | CRISPR/Cas9 KO | |
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效果 | 可逆转的基因敲低 | 不可逆转的基因敲除 |
实验难易程度 | 容易 | 适中,但获得单克隆后可一直使用 |
脱靶效应 | 脱靶效应极高 a)人工siRNA会与内源microRNA竞争蛋白,如RISC和dicer等,可能会影响microRNA的功能,进而影响其他基因的表达调控; b)一条siRNA可能会降解数百条转录产物; c)siRNA可能会与非靶mRNA的3’UTR相互作用,导致其降解。 | 特异性极高,脱靶效应低 |
抑制基因的效率 | 低 | 高 |
目标基因的种类 | 仅限mRNA编码基因(转录本太短无法设计有效shRNA的除外)、胞质IncRNA、circRNA(效果不佳) | 范围广泛,编码基因、非编码基因、胞质IncRNA、核内IncRNA、circRNA均可 |
2009年,研究人员使用RNAi的方法鉴定出STK33是携带着一种已知的人癌细胞的活力所必需的基因。此后,它作为一种潜在的药物靶标吸引了制药行业的大量关注。但随后惊奇发现,STK33根本不是癌细胞所必需,这是RNAi的脱靶效应造成的误判。此类的例子还有很多,因此,在国际期刊上发布RNAi相关文章时,经常会被要求补充验证非脱靶效应造成实验结果的论证数据。
除了高脱靶以外,RNAi技术经常会碰到的如下难题:
· 目的蛋白表达水平下调不明显,甚至造成蛋白表达增加;
· 高转化率的转录本难以被干扰;
· 非编码基因难以被干扰。
当然,如果想要暂时抑制基因功能而不改变遗传密码,或者想要下调基因功能而非完全抑制时,应用RNAi技术还是可取的。但这种种迹象已经在显示着RNAi的王者陨落已悄然临近......
Michael Bassik教授和Rene Bernards教授分别通过shRNA文库和CRISPR gRNA文库进行平行实验,证明使用gRNA文库筛选基因的效率和可靠性远比shRNA文库高。