RNAi和CRISPR，到底谁才是基因研究的“首选工具”？

RNAi和CRISPR，到底谁才是基因研究的“首选工具”？

RNA干扰（RNAi）技术曾是分子生物学研究的主力军，尤其在基因功能研究、靶点筛选、抗病毒及抗肿瘤研究中扮演着关键角色。然而，随着脱靶效应等问题逐渐暴露，以及CRISPR/Cas9技术的快速崛起，RNAi的局限性逐渐凸显。 CRISPR系统以其更高的特异性、稳定的敲除效果以及更广的适用范围，迅速成为基因编辑领域的“新宠”。本篇将系统梳理RNAi与CRISPR的原理、优劣、应用差异以及未来发展趋势，助您更好地选择实验工具。

原理解析

将体外合成的gRNA与Cas9蛋白形成RNP复合物，并与单链寡核苷酸（ssODN）供体模板共转染入细胞。Cas9识别并切割目标位点，细胞利用ssODN通过HDR机制修复，完成碱基替换。

RNAi因其简便性被广泛使用，但其局限性不容忽视，尤其在以下几方面：

· 脱靶效应严重：如2009年关于蛋白激酶STK33的研究误导了癌症药物研发方向，源于RNAi干扰非靶mRNA所致。

· 表达调控不稳定：siRNA/shRNA可能下调效果不明显，甚至导致蛋白表达上调。

· 靶点选择有限：对于高度表达的转录本、核内非编码RNA等难以干扰。

· 重复性较差：不同实验、不同文库之间结果不易重现。

这些问题不仅影响研究准确性，也在国际期刊投稿中增加了质疑声和审稿难度。

CRISPR技术的发展不仅提高了基因操作的精度，还扩大了研究的边界：

· 高特异性与低脱靶：Cas9酶的切割行为依赖gRNA与目标DNA的完美匹配及PAM序列识别，极大降低了非特异性干扰。

· 应用范围更广：不仅可用于基因敲除、激活，还能实现点突变、标签敲入、染色质结构研究等多种用途。

· 文库筛选更高效：Michael Bassik教授与Rene Bernards教授的对比研究显示，CRISPR文库在基因筛选中的命中率和重复性优于shRNA文库。

此外，CRISPR还催生了诸如CRISPRi（干扰）和CRISPRa（激活）等子技术，提供更灵活的调控方式。

尽管CRISPR被认为在多数场景中优于RNAi，但RNAi依旧有其不可替代的角色：

· 暂时性调控：适合进行基因功能的短期观察或剂量效应研究。

· 无需改变DNA序列：适用于不希望基因永久改变的实验条件。

· 验证CRISPR表型：在某些研究中，shRNA可用于验证CRISPR观察到的表型是否为脱靶假象。

正如Rene Bernards所指出，理想的策略应结合两者的优势，尤其在临床前研究中，双重验证更具说服力。

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参考文献

[1] Combined shRNA over CRISPR/cas9 as a methodology to detect of-target efects and a potential compensatory mechanism.
[2]CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.
[3] Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes.
[4] Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR.