CRISPR文库体外筛选，是指对构建好的细胞集群（cell pool）施加一定的压力，诱导其产生表型，再通过特定的方式将细胞进行富集的过程。在筛选过程中，经过基因编辑后而对筛选压力变得更加耐受的细胞群体会逐渐获得生长优势，而对筛选压力变得更加敏感的细胞则会发生凋亡或者生长阻滞的现象。通过这样一个“优胜劣汰”的过程，能够根据筛选后细胞所含sgRNA数量，评估出符合条件的功能靶点。
源井多样化表型筛选&分析平台
源井生物针对各类科研场景，建立了完善的表型筛选与数据分析平台，提供从实验设计到结果解析的精细化体外筛选服务，助力科研高效推进。
多样化的表型分析平台
成熟稳定的细胞生物学平台
全流程精细化服务
专业技术和项目管理团队指导
多样化的表型分析平台
成熟稳定的细胞生物学平台
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功能筛选体系的搭建
功能筛选体系是基于我们个性化的科研需求和目的表型来搭建的。 一个系统的
功能筛选体系由“压力施加”和“表型富集”两大部分组成。
压力施加
“压力施加”是指根据实验目的，对构建好的cell pool施加相应的筛选压力，诱导这些具有不同基因编辑的细胞在此过程中产生目的表型，让这些细胞在后续获取的阶段能够基于这种目的表型而被很好地加以区分。目前常见的“压力施加”方式有很多，可以通过不引入额外处理的方式，如传代培养，也可以在体系中引入特定的处理方式，如药物处理、病毒感染、功能细胞共培养以及细胞因子刺激等
传代培养
药物处理
病毒感染
细胞因子刺激
功能细胞共培养
其他处理方式
表型富集
“表型富集”是指针对压力施加后产生的目的表型，挑选相应的富集方式收集筛选后的细胞。目前常用的用以区分细胞集群的目的表型主要有细胞的增殖/凋亡情况、特异性标志物表达水平的变化以及行为学意义上的表型差异（如细胞迁移、细胞贴壁等）
基于细胞增殖/凋亡
基于行为学表型
基于细胞特异性标志物表达水平
搭建专属功能筛选体系
技术路线
借助多种压力条件与富集手段的正交搭配，源井生物打造了灵活多元的功能筛选体系。客户可根据具体科研目标，自主定制“施加压力”与“富集策略”，实现更精准的功能挖掘。
Cell pool构建
施加压力&表型富集
功能筛选体系
基因组DNA提取
NGS测序
交付报告&数据分析
体外筛选
体内筛选
压力施加
表型富集
传代培养
+基于细胞增殖/凋亡的富集方式
传代培养
+基于细胞特异性标志物表达水平的富集方式
传代培养
+基于行为学表型的富集方式
药物处理
+特定富集方式
感染病毒
+特定富集方式
功能细胞共培养
+特定富集方式
细胞因子刺激
+特定富集方式
应用场景
- 该筛选体系通常可用于：
- 细胞生长/存活必需基因的筛选
- 合成致死靶点的筛选
压力施加
表型富集
传代培养
+基于细胞增殖/凋亡的富集方式
应用场景
- 该筛选体系通常可用于：
- 细胞生长/存活必需基因的筛选
- 合成致死靶点的筛选
传代培养
+基于细胞特异性标志物表达水平的富集方式
应用场景
- 该筛选体系通常可用于：
- 抗原表位识别
- 信号通路调控机制研究
- 单基因调控机制研究
传代培养
+基于行为学表型的富集方式
应用场景
- 该筛选体系通常可用于：
- 细胞迁移相关调控因子
- 细胞贴壁相关调控因子
药物处理
+特定富集方式
应用场景
- 该筛选体系通常可用于：
- 肿瘤耐药基因筛选
- 药物协同作用基因筛选
- 药物作用靶点/机制研究
感染病毒
+特定富集方式
应用场景
- 该筛选体系通常可用于：
- 病毒感染宿主相关因子的探索
- 疫苗协同作用基因筛选
- 疫苗作用靶点/机制研究
功能细胞共培养
+特定富集方式
应用场景
- 该筛选体系通常可用于：
- 鉴定调控免疫细胞持久性/耗竭抵抗的基因
- 鉴定调控肿瘤细胞对免疫杀伤敏感性的基因
- 鉴定调控免疫细胞活化诱导细胞死亡的基因
- 鉴定影响细胞因子/营养竞争生存优势的基因
细胞因子刺激
+特定富集方式
应用场景
- 该筛选体系通常可用于：
- 细胞特定生物学过程促进/抑制因子的探索
- 信号通路调控机制研究
- 细胞因子作用靶点/机制研究
功能筛选体系：传代培养（压力种类）+细胞存活/增殖（富集方式）
1. CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells, Science.
应用:鉴定人黑色素瘤细胞与多能干细胞的生长必需基因
就目前而言，此类功能筛选体系已经并不多见，这是由于该方法在CRISPR筛选体系建立之初曾被大量使用，用于鉴定多种类型的细胞生长或增殖必需基因，如在该研究工作中，作者通过该功能筛选体系成功筛选出人黑色素瘤细胞与人多能干细胞生长必需的基因，对CRISPR筛选技术的推动以及肿瘤生物学领域提供了十分宝贵的指导作用和理论基础。
点击放大功能筛选体系：传代培养+基于细胞特异性标志物表达水平的富集方式
2. CRISPR screening identifies the deubiquitylase ATXN3 as a PD-L1-positive regulator for tumor immune evasion, J Clin Invest.
应用:单基因调控机制研究
作者构建了一个涵盖96个去泛素化酶家族成员的CRISPR筛选平台，通过分析PD-L1低表达和高表达细胞群体，鉴定出ATXN3是PD-L1转录的正调控因子。ATXN3缺失的肿瘤对低剂量抗PD-1治疗反应更好，其抑制可增强免疫检查点阻断治疗效果。
点击放大功能筛选体系：药物处理（压力种类）+细胞存活/增殖（富集方式）
3. Gliocidin is a nicotinamide-mimetic prodrug that targets glioblastoma, Nature.
应用：探索抗脑癌化合物Gliocidin的作用机制
在该项研究中，作者采用小鼠全基因CRISPR敲除文库（Brie），在NG2-3112实现CRISPR筛选。随后，作者通过不同浓度的Gliocidin（IC50和IC80）处理细胞，并在给药后的第0天和第14天收集细胞。正向筛选与负向筛选的结果显示，mTORC1的正向调节因子和负向调节分子分别会导致该肿瘤细胞对Gliocidin的敏感性在一定程度上发生相应的降低和增加，暗示了mTORC1通路在Gliocidin抗脑瘤药效作用上的重要性。
点击放大功能筛选体系：药物处理（压力种类）+ 流式分选（富集方式）
4. An E3 ligase network engages GCN1 to promote the degradation of translation factors on stalled ribosomes, Cell.
应用：筛选Ternatin-4介导eEF1A降解的作用机制
在本研究中，作者构建mCherry-eEF1A融合蛋白过表达细胞系，并通过CRISPRi抑制文库对该细胞系进行UPS基因集的筛选。基于前期对Ternatin-4促进eEF1A降解的发现，作者在体系中加入Ternatin-4，并根据mCherry的荧光强度高低对处理后的细胞进行富集，最终成功发现RNF14和RNF25对eEF1a和核糖体蛋白泛素化的关键介导作用。
点击放大功能筛选体系：药物处理（压力种类）+行为学特性（富集方式）
5. Whole-genome screens reveal regulators of differentiation state and context-dependent migration in human neutrophils, Nature Communications.
应用：探索参与粘附依赖性与非粘附依赖性细胞迁移、蛋白质运输和肌动肌肽细胞骨架调节的相关基因
在这项研究中，作者采用全基因组CRISPRi文库，并设计了三种实验模型以研究与中性粒细胞不同迁移运动相关的关键调控因子。在其中两种模型中，作者将细胞接种到具有3μm直径孔的径迹蚀刻膜上方的顶部储液器内，通过在储层不同部位添加10%的热灭活胎牛血清以调整化学引诱梯度，分别用于进行细胞有序趋化性和无序性趋化运动能力的评估。而最后一种模型则将细胞嵌入合成细胞外基质中来探测细胞变形虫样的三维迁移，用来模拟细胞通过组织间隙的迁移。通过此类模型，作者最终确定了344个敲低后能抑制细胞迁移比例的基因和31个敲低后能增加细胞迁移比例的基因，并成功揭示了mTORC1信号在HL60细胞分化中的作用，它影响中性粒细胞丰度，存活和迁移行为。
点击放大功能筛选体系：病毒感染（压力种类）+细胞存活/增殖（富集方式）
6. Replication competent HIV-guided CRISPR screen identifies antiviral factors including targets of the accessory protein Nef
应用：探索细胞抗病毒靶点
作者构建1500多种表达sgRNA的复制型HIV-1病毒，靶向500多个基因，筛选增强HIV-1复制适应性的sgRNA。通过在Cas9表达的CD4+ T细胞中传代和NGS分析，发现多个抗病毒因子（如GRN、CIITA、EHMT2等），限制HIV-1复制周期。
点击放大功能筛选体系：肿瘤/免疫细胞共培养（压力种类）+细胞存活/增殖（富集方式）
7. Integrating genome-wide CRISPR immune screen with multi-omic clinical data reveals distinct classes of tumor intrinsic immune regulators, J Immunother Cancer.
应用：筛选免疫抵抗调节因子
在该工作中，作者通过小鼠结肠癌细胞（MC38）与PmelT细胞共培养这种压力施加方式，旨在找到在免疫治疗中对治疗效果起到重要调控作用的未知基因。在功能筛选过程中，对于T细胞处理组，作者以效应细胞：靶细胞（E:T）比例为0.3:1和1:1加入培养的PmelT细胞处理16小时。对于非T细胞处理组，加入等量的T细胞生长培养基，检测对T细胞介导的细胞毒性的体外敏感性或抗性。研究揭示了两种不同的免疫抵抗调节器，并展示了它们作为治疗靶点提高免疫疗法疗效的潜力。在这些调节器中，PRMT1和RIPK1分别被确定为一种双重免疫抵抗调节器和一种细胞毒性抵抗调节器。尽管不同类型的免疫疗法之间的影响程度有所不同，但基因靶向PRMT1和RIPK1能使肿瘤对T细胞杀伤和抗PD-1/OX40治疗更为敏感。
点击放大功能筛选体系：细胞因子刺激（压力种类）+细胞存活/增殖（富集方式）；细胞因子刺激（压力种类）+流式分选（富集方式）
8. CRISPR–Cas9 screens reveal regulators of ageing in neural stem cells, Nature.
应用：从体外层面上寻找与衰老神经干细胞激活相关的重要调控基因
在该项研究中，作者通过全基因组敲除文库对年轻与衰老小鼠中分离出来的原代神经干细胞进行CRISPR筛选，在对静息态的神经干细胞进行文库病毒感染后，通过加入相关细胞因子，诱导神经干细胞从静息态到激活态的转换，增强神经干细胞的活性和增殖能力。在富集方式上，作者分别采用了两种方式，第一种方式是在激活后的第4天通过流式分选的方式分选出Ki67+的细胞以评估sgRNA的数量；而另一种则是基于激活态神经干细胞在增殖能力上的优势，在激活后第14天收集细胞，对sgRNA的数量进行检测。在这两种功能筛选体系的使用和配合下，作者成功找到了301个在敲除后能够在体外特异性地促进衰老神经干细胞激活的关键基因。
点击放大功能筛选体系：体内天然环境生长（压力种类）+行为学表型（富集方式）;
9. CRISPR–Cas9 screens reveal regulators of ageing in neural stem cells, Nature.
应用：从体内层面上寻找与衰老神经干细胞激活相关的重要调控基因
为了检验在体外平台中筛选得到的这些在敲除后能够促进NSC激活的功能靶点，作者进一步开发了针对老年小鼠大脑的体内功能筛选平台。脑室下区的qNSC能够在体内这种天然的环境下激活并产生子代，这些子代细胞会迁移至嗅球区域并分化为新生神经元，这个再生区域的天然特性为体内筛选提供了良好的模型。作者向老龄小鼠的侧脑室注射sgRNA文库病毒，感染脑室下区的神经干细胞，然后对感染5周后嗅球区域组织的基因组DNA进行测序分析。考虑到体内可用于筛选的细胞数量有限，所以作者利用这个体内筛选平台对体外平台中一些具有显著效果的功能靶点进行高效验证。
点击放大1. 筛选结果可信度如何判断，实验应设置哪些对照？
- a) 文库sgRNA设计中包含non-targeting sgRNA作为阴性对照，在富集筛选结果中，阴性对照的sgRNA均不会在正向或负向筛选中富集。
- b) 设置阳性对照sgRNA（在正向筛选或负向筛选中理论存在富集）；由于文库筛选无明显的阴性结果界定，阳性对照比阴性对照更重要。
- c) 在组别设计上，根据控制变量的原则，实验组和对照组之间的差别仅是处理和未处理。
2. 用流式分选的时候，是不是只要上样的细胞量达到300X以上覆盖度就行，不是指分选出来的细胞样本要300X细胞量对吧？
- a) 为确保最终收集到足量的细胞，流式分选前细胞量建议>500x细胞，否则收集细胞量过少，易造成实验误差。
- b) 分选后的细胞样本无需达到300X细胞量，为确保下游实验顺利进行，流式分选出的细胞最好不低于1*10^6。
3. 一般药物筛选推荐多少天，耐药株筛选一般选正筛还是负筛？
- a) 文献中药物筛选时长从1天至1月不等，多数筛选时长在14天；为确保筛选后存活细胞富集程度高，最终筛选结果更加显著，药物筛选一般推荐筛选14天或以上。
- b) 对于药物筛选，正筛或负筛取决于筛选压力。当筛选压力较高，正筛结果更加显著，可信度更高；当筛选压力较低（如传代培养），负筛结果更加显著，可信度更高。
4. 细胞表型不是药筛后死亡要用什么筛选方式？
细胞表型不是药筛后死亡，可使用流式分选、细胞迁移等能够将具有特定表型的细胞区分开的方法进行筛选。
5. 药物筛选为什么要进行预实验？
药物筛选进行预实验的目的是为了找到合适的药物筛选浓度；避免药物筛选浓度过低对细胞无明显的杀伤作用，或者药物筛选浓度过高导致大量细胞死亡，从而难以收集到足量细胞进行下游NGS测序分析。
6. 流式筛选一般是否需要pool细胞株培养，还是直接就过流式？
流式筛选一般建议pool细胞株培养1周左右。
- a)为了流式分选出足量的细胞，流式分选初始上样细胞量建议在2*10^7以上，为了获取足量的文库细胞，需要对其进行扩增。
- b)文库细胞中不能保证所有sgRNA都具有高编辑效率，为了使尽可能多的细胞发生基因编辑，需对文库细胞进行培养，以提高基因编辑时间窗口，增加细胞发生基因编辑的概率。
7. 我想要筛选耐药基因，要怎么筛比较好？
- a)筛选耐药基因可选择敲除文库负向筛选，或者激活文库正向筛选。
- b)一般耐药基因筛选，正向筛选结果可信度更高，对于敲除文库，正向筛选所得到的结论是该基因敲除后，细胞耐药。
8. pool细胞经过我们的抗体染色之后，通过流式分选，得到对应区域的细胞，提取基因组。该怎么去分组？
流式分组一般分为荧光表达量高（前5-10%）和荧光表达量低（后5-10%）两组。
