SNP研究离不开点突变细胞?源井4种构建方法分享给你!

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SNP研究离不开点突变细胞?源井4种构建方法分享给你!

 


随着二代测序的高速发展,越来越多的人类单核苷酸多态性位点(SNP,Single Nucleotide Polymorphisms)被证明与人类某些疾病密切相关,研究这些SNP相关疾病的发病机制或治疗方案,需要用到相应的点突变细胞模型。然而点突变细胞构建起来并不容易,选择合适的方法,可以让您事半功倍,到底有哪些方法呢?源井生物为您“揭秘”——


1. 最高效的方法——单碱基编辑器

原理描述:将表达gRNAdCas9/nCas9和脱氨酶等质粒共转到细胞内,在不产生双链断裂的前提下,利用脱氨酶对gRNA靶向位点的单个碱基进行替换,具有高效而又精确的基因编辑能力,可在动植物细胞内引入点突变,也可以对致病性点突变进行纠正。其中,腺嘌呤单碱基编辑器(简称ABE),可以对目标位点实现AG/TC的单碱基转换,胞嘧啶单碱基编辑器(简称CBE),可以对目标位点实现CT/GA的单碱基转换,目前主要采用BE3系统。

应用场景:符合特定碱基变换,且能找到合适gRNA。突变纠正等疾病治疗需求。

实验路线:1)方案设计时,在点突变位点附近寻找gRNA,使得目标突变点恰好处于单碱基编辑器的编辑窗口内,且编辑窗口内无其他同碱基非目标突变。无需设计Donor2)通过质粒(双链DNA)作为载体将编辑系统导入细胞。3)通常采用电转或脂质体的方式进行转染。4)无法仅通过PCR跑胶来筛选阳性克隆,一般需要测序比对。

优点:编辑效率高,能精准实现单碱基突变。不会造成DNA双链断裂,减少indel的发生。更安全,不易脱靶。

缺点:只能实现特定单碱基之间的转换,无法满足大部分科研需求。编辑窗口内如果有其他同碱基非目标靶点,也无法使用,应用有较多限制。


2. 最主流的方法——RNP

原理描述:gRNACas9蛋白在体外形成RNP复合物,再与单链Oligo共转染进细胞,由RNP复合物对基因组靶点进行识别与切割,再以单链Oligo为模板进行同源重组修复,实现基因点突变的目的。

实验路线:1)方案设计时,需要在点突变上下游20个碱基内找到特异性和切割效率高的gRNA,单链oligo模板长度较短,设计120nt左右即可。2)选择sgRNACas9蛋白作为载体。3)通常采用电转法或脂质体法进行转染。4)无法仅通过PCR跑胶来筛选阳性克隆,一般需要测序比对。

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优点:适用性广,编辑效率高,流程简单,项目周期短。

缺点:需要在点突变附近选择gRNA,有一定的空间局限性;gRNA容易降解,对操作要求高。


3. 突破RNP法的局限——质粒抗性法

原理描述:使用gRNACas9共表达的质粒,与Donor质粒一起共转染细胞。Donor质粒两条同源臂中间构建了一个两端带有loxp重组位点的抗性基因表达盒,目标点突变则通过同源臂引入。转染后通过加药筛选,使没有重组成功的细胞被杀死,提高阳性率,筛选到纯合克隆后,再转入一个表达Cre重组酶的质粒,将抗性基因删除,完成模型制作。

应用场景:适用部分RNP无法设计的点突变需求

实验路线:1)通常在突变位点附近的内含子处设计gRNA,以切割位置作为中心设计左右同源臂,同源臂一般较长,约600-1000bp2gRNACas9Donor都是质粒(双链DNA)作为载体。3)通常采用电转法或脂质体法进行转染。4)可以通过PCR跑胶进行单克隆初筛,复检再测序比对。

优点:受突变点位置的限制较小,通过抗性筛选,可以提高阳性率。

缺点:流程复杂,周期长。抗性基因删除后,内含子处会有LoxP位点残留。


4. 突破难转染细胞的方法——AAV-Donor

原理描述:AAV作为载体带入Donor模板进行同源修复,AAV基因组是游离的DNA单链,而且在细胞内可以保留较长时间,可以大幅提升同源重组效率。

应用场景:难转染的细胞,尤其是悬浮细胞

实验路线:1)通常在突变位点上下游50个碱基内设计gRNA,以切割位置作为中心设计左右同源臂,同源臂一般较长,约600-800bp2Cas9通常以慢病毒的形式稳转,sgRNA和和Donor构建在AAV载体骨架上。3)通常采用AAV法进行感染,慢病毒作为辅助。4)通常不设计同时重组抗药性,所以无法仅通过PCR跑胶来筛选阳性克隆,需要测序比对。

优点:AAV为单链DNA病毒,能游离在细胞中作为模板,重组效率高。适用于悬浮细胞等难转染的细胞系。AAV在临床应用具有较高的安全性,所以在疾病疗法方面,前景广阔。

缺点:AAV病毒包装时间较长费用昂贵。对于血清型未知的细胞系,还需要测试血清型,周期较长,费用高。

总的来说,就是单碱基编辑器效率最高,流程简便,但是门槛也比较高,如果不符合单碱基编辑器的设计要求,通常情况选择RNP;如果RNP法在突变位置附近选不到合适的gRNA,就考虑质粒抗性法扩大gRNA选择范围。对于难转染的悬浮细胞,还可以选择AAV来解决转染问题和提高重组效率。

那么是不是选择同一种系统,大家拿到点突变细胞的概率就一样呢?其实不然,整个实验路线有很多细节可以优化,比如在PAM结构引入同义突变防止回切;在Cas9稳转株基础上构建,提升转染效率;或者调整同源臂长度和GC含量、以及在转染后加入抑制NHEJ修复路径的试剂,提升同源重组效率等,这些环节优化得好都可以提升点突变效率,具体就需要实验摸索和一定的经验啦。

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