SNP研究离不开点突变细胞？源井4种构建方法分享给你！

SNP研究离不开点突变细胞？源井4种构建方法分享给你！

随着二代测序的高速发展，越来越多的人类单核苷酸多态性位点（SNP,Single Nucleotide Polymorphisms）被证明与人类某些疾病密切相关，研究这些SNP相关疾病的发病机制或治疗方案，需要用到相应的点突变细胞模型。然而点突变细胞构建起来并不容易，选择合适的方法，可以让您事半功倍，到底有哪些方法呢？源井生物为您“揭秘”——

1. 最高效的方法——单碱基编辑器

原理描述：将表达gRNA、dCas9/nCas9和脱氨酶等质粒共转到细胞内，在不产生双链断裂的前提下，利用脱氨酶对gRNA靶向位点的单个碱基进行替换，具有高效而又精确的基因编辑能力，可在动植物细胞内引入点突变，也可以对致病性点突变进行纠正。其中，腺嘌呤单碱基编辑器（简称ABE），可以对目标位点实现A→G/T→C的单碱基转换，胞嘧啶单碱基编辑器（简称CBE），可以对目标位点实现C→T/G→A的单碱基转换，目前主要采用BE3系统。

应用场景：符合特定碱基变换，且能找到合适gRNA。突变纠正等疾病治疗需求。

实验路线：1）方案设计时，在点突变位点附近寻找gRNA，使得目标突变点恰好处于单碱基编辑器的编辑窗口内，且编辑窗口内无其他同碱基非目标突变。无需设计Donor。2）通过质粒（双链DNA）作为载体将编辑系统导入细胞。3）通常采用电转或脂质体的方式进行转染。4）无法仅通过PCR跑胶来筛选阳性克隆，一般需要测序比对。

优点：编辑效率高，能精准实现单碱基突变。不会造成DNA双链断裂，减少indel的发生。更安全，不易脱靶。

缺点：只能实现特定单碱基之间的转换，无法满足大部分科研需求。编辑窗口内如果有其他同碱基非目标靶点，也无法使用，应用有较多限制。

2. 最主流的方法——RNP法

原理描述：将gRNA和Cas9蛋白在体外形成RNP复合物，再与单链Oligo共转染进细胞，由RNP复合物对基因组靶点进行识别与切割，再以单链Oligo为模板进行同源重组修复，实现基因点突变的目的。

实验路线：1）方案设计时，需要在点突变上下游20个碱基内找到特异性和切割效率高的gRNA，单链oligo模板长度较短，设计120nt左右即可。2）选择sgRNA和Cas9蛋白作为载体。3）通常采用电转法或脂质体法进行转染。4）无法仅通过PCR跑胶来筛选阳性克隆，一般需要测序比对。

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优点：适用性广，编辑效率高，流程简单，项目周期短。

缺点：需要在点突变附近选择gRNA，有一定的空间局限性；gRNA容易降解，对操作要求高。

3. 突破RNP法的局限——质粒抗性法

原理描述：使用gRNA和Cas9共表达的质粒，与Donor质粒一起共转染细胞。Donor质粒两条同源臂中间构建了一个两端带有loxp重组位点的抗性基因表达盒，目标点突变则通过同源臂引入。转染后通过加药筛选，使没有重组成功的细胞被杀死，提高阳性率，筛选到纯合克隆后，再转入一个表达Cre重组酶的质粒，将抗性基因删除，完成模型制作。

应用场景：适用部分RNP无法设计的点突变需求

实验路线：1）通常在突变位点附近的内含子处设计gRNA，以切割位置作为中心设计左右同源臂，同源臂一般较长，约600-1000bp。2）gRNA、Cas9和Donor都是质粒（双链DNA）作为载体。3）通常采用电转法或脂质体法进行转染。4）可以通过PCR跑胶进行单克隆初筛，复检再测序比对。

优点：受突变点位置的限制较小，通过抗性筛选，可以提高阳性率。

缺点：流程复杂，周期长。抗性基因删除后，内含子处会有LoxP位点残留。

4. 突破难转染细胞的方法——AAV-Donor法

原理描述：以AAV作为载体带入Donor模板进行同源修复，AAV基因组是游离的DNA单链，而且在细胞内可以保留较长时间，可以大幅提升同源重组效率。

应用场景：难转染的细胞，尤其是悬浮细胞

实验路线：1）通常在突变位点上下游50个碱基内设计gRNA，以切割位置作为中心设计左右同源臂，同源臂一般较长，约600-800bp。2）Cas9通常以慢病毒的形式稳转，sgRNA和和Donor构建在AAV载体骨架上。3）通常采用AAV法进行感染，慢病毒作为辅助。4）通常不设计同时重组抗药性，所以无法仅通过PCR跑胶来筛选阳性克隆，需要测序比对。

优点：AAV为单链DNA病毒，能游离在细胞中作为模板，重组效率高。适用于悬浮细胞等难转染的细胞系。AAV在临床应用具有较高的安全性，所以在疾病疗法方面，前景广阔。

缺点：AAV病毒包装时间较长，费用昂贵。对于血清型未知的细胞系，还需要测试血清型，周期较长，费用高。

总的来说，就是单碱基编辑器效率最高，流程简便，但是门槛也比较高，如果不符合单碱基编辑器的设计要求，通常情况选择RNP法；如果RNP法在突变位置附近选不到合适的gRNA，就考虑质粒抗性法扩大gRNA选择范围。对于难转染的悬浮细胞，还可以选择AAV法来解决转染问题和提高重组效率。

那么是不是选择同一种系统，大家拿到点突变细胞的概率就一样呢？其实不然，整个实验路线有很多细节可以优化，比如在PAM结构引入同义突变防止回切；在Cas9稳转株基础上构建，提升转染效率；或者调整同源臂长度和GC含量、以及在转染后加入抑制NHEJ修复路径的试剂，提升同源重组效率等，这些环节优化得好都可以提升点突变效率，具体就需要实验摸索和一定的经验啦。

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