环状RNA及其基因编辑

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环状RNA及其基因编辑
环状RNA(circular RNAs, circRNAs)是一类由mRNA 前体(pre-mRNA)经反向剪接形成的共价闭合环状非编码RNA。circRNA最早是在上世纪70年代在病毒中被发现,但是由于早期RNA文库制备广泛使用polyA富集的方式(circRNA没有游离的5’和3’末端),以及RNA-seq读数要求以线性方式与基因组对齐的计算算法,导致大量circRNA的信息被遗漏,使得人们一度认为环状 RNA 只是错误剪接的副产物,对circRNA的关注并不高。
随着高通量测序技术和生物信息学的发展,成千上万种circRNA被发现,围绕着circRNA的基础研究也越来越多。大量研究表明circRNA在哺乳动物细胞中具有内生、丰富、保守、稳定等特点,并经常表现出组织或时空特异性,可以通过多种机制参与机体生长发育调控,以及疾病的发生和发展。因此,近年来circRNA逐渐成为非编码RNA研究领域的热点。
源井生物可提供的环状RNA相关服务:
cicrRNA相关服务
什么是circRNA
circRNA的类型
根据circRNA序列的来源,可以分为3类:
· 序列全部来源于外显子,称为Exonic circRNAs
· 序列来源于外显子和内含子,称为EIciRNAs
· 序列全部来源于内含子,称为ciRNAs
circRNA的形成的机制
circRNA是由mRNA前体(pre-mRNA)经反向剪接(back-splicing)形成的,目前报道的成环模型主要有以下3种:
· 内含子反向互补序列驱动环化
外显子两端的侧翼内含子含有多对反向互补序列,反向互补序列促使内含子序列配对,使得下游的剪接供体(Splice-Donor)与上游的剪接受体(Splice-Acceptor)靠近,从而结合形成环状RNA。(图1.左)
· RNA结合蛋白驱动环化
环化外显子两端的侧翼内含子含有RNA结合蛋白(RBPs)识别的基序,RBP分别与两翼内含子特异基序结合后,会形成二聚体,促进两翼内含子互相靠近,进而连接成环。(图1.右)
内含子反向互补序列驱动环化图
· 套索驱动环化
mRNA前体剪接时,会发生外显子跳读事件,产生包含外显子和内含子的套索中间体,随后该中间体发生反向剪接,形成环状RNA。(图2.)
RNA结合蛋白驱动环化图
circRNA的功能
circRNA最常见的功能是作为miRNA海绵体与miRNA结合,从而影响miRNA对基因的调控。比如研究得比较多的小脑退行性相关蛋白基因(CDR1)反义链转录的环状RNA分子: Cdr1as,它包含约70个miR-7 的结合位点和1个miR-671结合位点,其中与miR-7的结合方式是非完全互补,只是结合,不会被AGO2蛋白介导降解,而与miR-671的结合方式是完美的互补。当Cdr1as高表达时,miR-7被结合,无法抑制原癌基因的mRNA,从而上调原癌基因的表达,导致癌症的发生。当miR-671高表达时,Cdr1as被降解,miRNA得到释放,与原癌基因mRNA结合,起到基因下调的作用,抑制癌症的发生。(图3.)
circRNA的功能

很多环状RNA上含有蛋白结合的位点,可以作为蛋白的海绵体。如RNA剪切因子MBL,可结合亲本基因第二外显子,促使其环化形成circ-Mbl,circ-Mbl又能与MBL结合,降低MBL有效浓度,减少MBL生成。
除了作为miRNA及蛋白海绵体,circRNA还可以作为支架蛋白促进酶的共定位、结合转录因子抑制靶基因表达、参与亲本基因表达调控、在特定的情况下还可以翻译出多肽。根据参与的功能不同,circRNA所处的细胞定位也不同,如作为miRNA或蛋白海绵体时,circRNA需由细胞核运输到细胞基质起作用,而参与亲本基因表达调控或结合转录因子抑制靶基因时,circRNA常在细胞核中起作用。
参考文献:
Kristensen, L. S., Andersen, M. S., Stagsted, L. V., Ebbesen, K. K., Hansen, T. B., & Kjems, J. (2019). The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics, 20(11), 675-691.
circRNA敲除
随着越来越多内源性的circRNA被发现在人体组织中有着广泛表达,circRNA与疾病的关系逐渐成为焦点。目前研究最多的是circRNA与实体瘤之间的关系,促进肿瘤生成的一些circRNA,如头颈部鳞状细胞癌中的circPvt1;结直肠癌,食道鳞状细胞癌和肝细胞癌中的cirs-7(CDr1as)。抑制肿瘤的circRNA,如胶质母细胞瘤中的circsMARCA5 and circ-SHPRH。还有一些circRNA在不同组织或不同细胞所起的作用可能不同,如circHiPK3,在直肠癌中是原癌基因,但是在膀胱癌中又是抑制癌细胞的。
除了癌症,研究还发现circRNA与糖尿病,心血管疾病,慢性炎症和神经系统疾病都有密切的关系。相信随着生物技术的发展以及越来越多对circRNA的深入研究,circRNA的形成和作用机理可以更加清晰,在疾病预防,检测及治疗方面也可以起到重要的作用。

circRNA敲除是指在基因DNA水平进行编辑,达到彻底敲除的目的。CRISPR-U™是源井生物自主研发的细胞基因编辑技术,比普通CRISPR/Cas9技术的基因切割效率提高10-20倍。通过CRISPR-U™将gRNA和Cas9转入细胞中,药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序验证,筛选出敲除circRNA的阳性克隆。
circRNA敲除方案比较难设计,一般会使用以下两种方法:

方案一

将两条gRNA分别设计在circRNA exon的两端,直接敲除环化的外显子序列。这种方案虽然敲除彻底,但是在敲除circRNA的同时,也会影响到编码蛋白的亲本基因,需要根据具体的实验目的考虑是否可行。                                                 

方案二

通过破坏circRNA成环来达到敲除的目的。需要先找到circRNA的成环元件,成环元件一般位于被环化外显子两端的长侧翼内含子中。找到成环元件后,在两端设计gRNA进行敲除,既不破坏编码基因的外显子,又可以实现circRNA的敲除(图4.)

circRNA敲除方案
源井生物凭借丰富的基因编辑方案设计经验,对circRNA设计敲除外显子侧翼内含子中的成环元件的方案,来达到破坏circRNA成环同时又不影响编码基因表达的目的。结合CRISPR-U™高效编辑技术,效率是普通方法的10倍,可以快速筛选出circRNA敲除的阳性克隆。
应用案例:
circ-HIPK3是人体细胞内含量丰富的一种环状RNA,它可以与多种miRNA结合,作为细胞生长的调节剂,影响肿瘤的形成。为了验证circ-HIPK3成环的机制,需要找到侧翼内含子中的成环元件,对上下游预测的两个成环元件分别设计一对sgRNA,利用CRISPR/Cas9系统将预测的成环元件进行敲除,检测circRNA表达情况是否发生变化。经过PCR和RT-QPCR验证,发现下游成环元件敲除后,circHIPK3表达明显下调,而上游成环元件敲除后,circHIPK3的表达不仅没有下调还有所升高。推测可能是上游的成环元件序列太多,预测的不准确。为了进一步验证是其他成环元件驱动的成环,将gRNA3或gRNA4分别与gRNA5或gRNA6共注射,敲除成环元件上游大片段内含子。RT-QPCR结果显示circHIPK3表达确实下降了,说明上游是由其他的成环元件起到成环的作用。
参考文献:
Zheng, Q., Bao, C., Guo, W., Li, S., Chen, J., Chen, B., ... & Liang, L. (2016). Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature communications, 7(1), 1-13.
circRNA敲降(干扰)
在研究circRNA功能的方法中,最经典的抑制circRNA的方法是通过RNAi的方式(shRNA)进行敲降。为了避免影响到mRNA,设计方案时需将干扰序列设计在反向剪接位点(BSS)处。
源井生物通过设计高效的shRNA,用慢病毒法将干扰载体转入细胞中,根据最佳药筛浓度对细胞进行药物筛选,直到对照组细胞全部死亡,获得circRNA敲降的稳定细胞株。
应用案例:
用siRNA进行敲降后,通过检测细胞增殖凋亡情况,说明circ-HIPK3敲除后抑制细胞增殖。首先设计三组实验,分别针对HIPK3 mRNA线性转录本、circ-HIPK3环状转录本和两种转录本共有部分设计siRNA,并在HEK-293 T细胞系上验证设计的siRNA只干扰相应的转录本。
circRNA敲降
利用增殖凋亡检测试剂盒:CCK-8和EdU进行细胞增殖凋亡检测,结果显示HIPK3 mRNA敲降后不明显影响细胞增殖,而circ-HIPK3敲降后,会明显抑制细胞增殖。

circRNA干扰
参考文献:
Zheng, Q., Bao, C., Guo, W., Li, S., Chen, J., Chen, B., ... & Liang, L. (2016). Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature communications, 7(1), 1-13.
circRNA过表达
circRNA过表达一直有成环效率低,容易错配成环等难点。通过优化侧翼成环框架,如成环元件、QKI等RBP的结合位点,使circRNA准确高效环化。过表达后仍需要检测是否成功成环,以及线性mRNA是否表达。为了研究一种新环状RNA载体表达系统的成环效率,选择小鼠circRtn4环状基因在多种细胞系(包括Hela,N2a,HEK293)中进行表达验证。根据不同细胞系中进行的RT-QPCR实验数据显示,新载体系统pCircRNA-DMo-Rtn4成环效率在几种不同的细胞系中均比普通的载体系统(pCircRNA-BE-Rtn4)要高效得多。
circRNA过表达
circRNA的检测与鉴定

Northern Blotting是检测circRNA的金标准,探针通常跨反向剪接位点设计。但由于Northern Blotting需要的circRNA量非常大,耗时间精力,而且探针一般是放射性标记,操作上比较困难。常用的检测方案还是用RT-PCR或者是RT-QPCR,引物设计在反向剪接位点两端。(图9.)

circRNA的检测与鉴定
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