非编码RNA的功能研究，你的方法对吗？

人类基因组DNA核苷酸序列中约93％能被转录为RNA，其中仅2％的转录产物被翻译为蛋白质, 余下98％属于非编码RNA(ncRNA)。随着microRNA的研究进展,揭示了ncRNA在人类基因转录后调节、细胞生长、分化、增殖中起着相当重要的作用。ncRNA的研究热度最高的主要是microRNA、circRNA、lncRNA。近年来，越来越多科研学者投身非编码RNA的研究中，且硕果累累，以下是自2018年以来各种非编码RNA相关的文章发表数目和国自然基金数目：

非编码RNA	国自然基金数目	文章发表数*
microRNA	1000	39400
circRNA	300	3700
lncRNA	700	17600
		来自谷歌学术

研究非编码RNA功能的方法有哪些？该如何选择？

对非编码RNA的研究，可以从功能获得性和功能缺失性进行验证。过表达、RNA模拟物、RNA激动剂可以进行功能获得性验证。对于功能缺失性研究，目前常用的方法有RNAi、RNA抑制剂、拮抗剂、反义寡核苷酸（ASO）、启动子敲除、基因敲除等。

1）RNAi沉默非编码RNA的效果较差，甚至无法干扰某些circRNA和lncRNA。因为RNA干扰在转录后水平起作用的，也就是说RNA要被干扰就要定位在胞浆中，但是，lncRNA是选择性分布在核内和胞质中的，circRNA也有部分定位在细胞核中。因此，传统用于mRNA功能缺失研究的siRNA和shRNA工具不适合lncRNA和circRNA功能缺失性研究。此外，RNAi的脱靶效率极高，容易造成对RNA功能的误判。
2）RNA抑制剂、拮抗剂由于活性和稳定性的限制，不易通过细胞膜。此外，这两种方法主要应用于microRNA的研究，均无法应用在circRNA和lncRNA研究中。

3）ASO无法完全阻止RNA转录和在DNA层面干扰表达。此外，使用ASO方法无法获得稳转株。

CRISPR/Cas9介导的基因敲除可以完美避开上述所有弱点！

基因敲除、启动子敲除在DNA层面完全阻止RNA的表达，并且可以获得稳转株，一次操作，永久使用，是研究长非编码RNA功能最有效的方法！

这两种敲除均可以通过CRISPR/Cas9技术实现。而且CRISPR/Cas9的脱靶效应极低，大大减少了由于脱靶效应带来的误判。安全又好使！