CRISPR文库筛选常见问题超详细解析
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CRISPR文库筛选常见问题超详细解析
CRISPR文库筛选 是功能基因组学研究的核心工具，流程涉及文库构建、病毒递送等多个复杂环节。结合丰富的CRISPR文库筛选实操经验，小源今天就针对许多常见的问题给大家做详细解答，助力提升实验成功率~
1.全基因组文库A库和B库的差别？
共同点：两个库均针对全基因组的各编码基因分别设计3条不同的sgRNA
区别：全基因组文库A库额外针对microRNA设计了不同的sgRNA序列
2.如何选择合适的 CRISPR 文库类型（文库大小、基因种类、sgRNA 数量）？
① 文库sgRNA条数越多，操作量越大，难度越高；
② 针对每个基因设计的sgRNA条数越多，最终筛选的结果可信度越高；
③ 文库中的基因数量越多，覆盖的靶基因数量越多，同时假阳性/假阴性靶点发现率也会越高。
3.怎么保证文库质粒的覆盖度和均一性？
① 使用电转的方法扩增质粒，保证细胞转化效率；源井生物独家研发的菌株和电转感受态制备方法，保证质粒高效电转效率。
② 重复多次电转，保证电转后的长菌数；通过计数板计算电转后菌落数的覆盖度>300x。
4.已经转入sgRNA文库的 cell pool可以直接进行筛选实验吗？
可以，文库筛选的目的是通过施加特定的筛选压力，从而富集目的细胞，并经过NGS测序判别富集细胞中对应的sgRNA类型，以此确认靶基因。在筛选前保证文库细胞中的sgRNA覆盖率高于90%以上，即可确保绝大多数的靶点在筛选前存在于细胞池中未被丢失，通过施加特定压力富集目的细胞后，即可寻找有效靶点。
5.可供哪几种定制CRISPR文库？
源井生物定制文库涵盖常规的单sgRNA定制文库、双sgRNA定制文库和AAV病毒定制文库等多种形式，且可以根据细胞的荧光、抗性以及是否携带Cas9元件等进行多元化文库质粒载体定制。
6.文库病毒包装与普通病毒包装的区别，如何保证文库病毒滴度？
① 文库单质粒系统病毒携带目的片段长，包装难度相比普通病毒更高；源井生物使用自研转染培养基、优化病毒包装体系，保证文库病毒包装效率和滴度。
② 文库病毒中携带多条不同sgRNA，为保证sgRNA覆盖度，批次包装量更大。
7.购买的文库病毒如何保存，保存期限是多久？
文库病毒中含有多条sgRNA，保存不当或存放时间过久可能导致一些低频的sgRNA丢失，从而影响文库细胞中sgRNA覆盖度。
① 文库病毒置于-80℃冰箱存放，避免反复冻融。
② 为保证文库病毒中sgRNA覆盖度，建议半年内使用完；若存放时间过久需重新检测病毒滴度，若滴度下降严重应丢弃。
8.文库细胞可以传代吗？可以传多少代？
对于实验目的不是寻找必须基因靶点的筛选，文库细胞可以传代。 在传代过程中需复苏1份或以上（300x/500x）的细胞量进行扩增，并保证细胞扩增在5代以内，以确保在筛选前文库细胞中的sgRNA覆盖率>90%。
9.复苏时死了很多细胞，覆盖度会不会有丢失？
① 死细胞过多对覆盖度有一定影响，直接进行筛选可能会导致最终筛选结果中一些关键基因被遗漏。
② 源井生物发货时已经考虑了客户复苏细胞时，会有一小部分细胞死亡，有多给客户一些细胞，所以如果客户复苏细胞时，死亡率在30%以内是没有问题的，可以保证细胞覆盖度。
10.筛选结果可信度如何判断，实验应设置哪些对照？
① 文库sgRNA设计中通常包含non-targeting sgRNA作为阴性对照，在富集筛选结果中，理论上阴性对照的sgRNA均不会在正向或负向筛选中富集。
② 设置阳性对照sgRNA（在正向筛选或负向筛选中理论存在富集），通过阳性对照是否富集来确保筛选的过程是符合实验预期的；由于文库筛选无明显的阴性结果界定，阳性对照比阴性对照更重要。
