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对于许多严重的疾病，例如心力衰竭、晚期糖尿病、血友病、骨髓瘤、末期肝硬化等，目前还未能研发出完全治愈这些疾病的药物，最有效的方法是异体移植。但是由于供体有限以及自体免疫排斥反应的风险，科学家们苦心专研，尝试寻找除异体移植外，更高效、安全的治疗方法。诱导型多能干细胞(induced
pluripotent stem
cells,iPSC)可以来源于受体本身的体细胞，排除了免疫排斥反应的风险，且具有不断自我更新和多向分化潜能，iPS细胞来源的心肌细胞、肝细胞、神经细胞、T细胞、造血干细胞和胰岛细胞的移植治疗能够有效解决许多医学难题。
通过CRISPR/Cas9的方法，将模拟疾病发生的突变引入iPSC，或修复iPSC疾病模型中的突变,
再分化得到所需要的细胞进行研究或治疗，是目前iPSC研究的大热门。
神经干细胞和神经元
经iPSC体外分化获得的神经干细胞可用于建立神经系统疾病的细胞模型，此途径避免了伦理约束和免疫排斥反应，是体外获得NSC的较理想的途径。
iPSC在适当条件下可以实现神经元分化。例如定向分化为运动神经元（MN），为治疗和研究MN损伤疾病例如肌萎缩侧索硬化（ALS）、脊髓肌萎缩症（SMA）等提供了可能性。
T细胞
iPSC可分化产生的T细胞，基于iPSC开发的CAR-T细胞疗法具有调解更安全、更有效的药理活性，包括与其他癌症治疗周期相结合的巨大潜力，能够不受患者限制，及时获得现成可用的T细胞癌症免疫疗法。
心肌细胞
iPSC来源的心肌细胞为疾病特异性和个体特异性心血管疾病的发病机制研究提供了新的方法和思路，已经成为心血管领域研究的有效工具,也为临床治疗带来新希望。
肝细胞
由iPSC诱导分化而来的肝脏细胞可缓解当前肝脏器官移植和肝细胞移植所存在的来源短缺的问题，更有利于其基础及临床研究的需要。此外，诱导的肝细胞样细胞在未来还可能作为一种工具，模拟和研究肝脏疾病及筛查药物的肝脏毒性。
胰岛细胞
iPSC在体外将其诱导为有分泌胰岛素功能的胰岛β样细胞可以用于糖尿病相关疾病的疾病机制研究，药物开发，以及针对糖尿病的细胞疗法研究。使用此来源的胰岛β细胞进行移植治疗糖尿病，可以较好地解决既往成体胰岛移植所面临的伦理、来源受限等诸多难题。
造血干细胞
人体造血干细胞（HSC）数量有限，体外扩增培养困难以及移植物抗宿主病等限制了HSC移植的应用。iPSC经体外诱导分化生成大量可以移植的自体HSC，为恶性血液疾病的治疗带来了曙光。
源井的iPSC平台:
重编程服务
通过在体细胞中转入几个特定的转录因子，例如Oct3/4、Sox2、c-Myc和KlF4,可实现体细胞核的重编程，从而获得可不断自我更新且具有多向分化潜能的类胚胎干细胞样细胞iPSC。
iPSC重编程 (reprograming)的主要步骤：
· 用载体将几个转录因子转入体细胞，使之重编程形成iPSC；
· 对获得的
iPSC进行基因型和表型的鉴定。
基因编辑服务
CRISPR/Cas9核酸酶可以形成特定序列的双链DNA断裂（DSB）。当细胞使用非同源末端连接（NHEJ）途径修复这些基因时，会产生小的插入或删除突变（indels）并扰乱基因。或者，DSB可以通过同源重组修复途径（HDR）特异性改变碱基，或者可以使用donor
vector来形成基因插入。由于CRISPR/Cas9易于构建和在人细胞中的毒性较低，在基因编辑中备受青睐。然而，由于iPSC不像普通肿瘤细胞系那样具有总染色体异常和异常强烈的DNA损伤反应的特点，基因编辑在人类iPSC中成功率更低。CRISPR-U™采用了最大化基因组编辑效率的策略，我们在人类iPSCs中获得的基因切割效率和同源重组效率比传统方法提高10倍。
基因敲除
CRISPR-U™基因敲除iPSC细胞通过核转染法将gRNA和Cas9转入iPSC细胞中，药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序验证，筛选出基因敲除的阳性克隆。
| 类型 | 小片段敲除 | 移码敲除 | 片段敲除 |
|---|---|---|---|
| 方案 | 小片段敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。 | 移码敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。 | 大片段敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。 |
| 应用 | 通过基因失活研究基因功能 | ||
应用案例：
人T-iPSC分化的CD8αβ细胞在CD4/CD8双阳性分化过程中，通过T细胞受体（TCR）α链的重排而失去抗原特异性。使用CRISPR/Cas9敲除T-iPSCs中重组酶基因（RAG2）阻止了这种额外的TCR重排。含有稳定的TCR的CD8αβ-T细胞在异种移植肿瘤模型能有效地抑制肿瘤生长。这些方法有助于安全有效的T细胞免疫治疗。
gRNA和RAG2基因敲除的目标序列。阳性克隆在指定位置的双等位基因RAG2中有移码突变。
WT与RAG2基因敲除T-iPSCs对右旋异构体（dextramer）结合能力的比较。RAG2-/-T-iPSCs成功地分化为表达稳定TCR的CD8αβ细胞，而RAG2wt/wt-iPSC衍生的CD8αβ细胞有40%失去了抗原特异性。
参考文献：
Minagawa, Atsutaka, et al. "Enhancing T cell receptor stability in
rejuvenated iPSC-derived T cells improves their use in cancer
immunotherapy." Cell Stem Cell 23.6 (2018): 850-858.
基因点突变
CRISPR-U™基因点突变iPSC细胞
通过核转染法将gRNA载体（含Cas9）和Donor共转入细胞中，gRNA和Cas9复合物造成靶位点DNA双链断裂后，iPSC细胞以外源携带目标点突变的Donor作为模板进行同源重组修复（HDR），将目标点突变重组到基因组靶位点。
gRNA载体携带抗性，可进行药筛，药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序，筛选出点突变纯合的阳性克隆。
应用案例：
细胞疾病模型建模通过HDR，携带点突变序列的donor oligo (ssODN)替换WT对应的碱基。
细胞疾病模型建模通过HDR，携带WT序列的donor oligo (ssODN)替换对应的突变碱基。
PSEN1基因A79V突变可引起阿尔茨海默症。研究表明，将阿尔茨海默症患者的体细胞诱导为多能干细胞（iPSC），然后通过用野生型序列替换点突变序列，修正突变的基因。通过研究患者的iPSC和修正后的iPSC，可以得知该突变对细胞表型的影响，从而深入研究该突变的病理性作用。
用于修复A79V-hiPSC点突变的gRNA序列和ssODN。
· A
突变位点附近的基因组序列：红色的T是需要被修正的核苷酸；黄色的是sgRNA识别位点，加粗的AA是Cas9的切割位点；粉红色的是正反向引物。
· B Donor oligo序列,
绿色的C是修正后的核苷酸。
iPSC中PSEN1基因的序列分析。
· A
点突变修正后的杂合子测序结果。
· B
点突变修正后的纯合子测序结果（T>C）。
参考文献：
Pires, C., Schmid, B., Petræus, C., Poon, A., Nimsanor, N., Nielsen, T.
T., ... & Freude, K. K. (2016). Generation of a gene-corrected isogenic
control cell line from an Alzheimer's disease patient iPSC line carrying
a A79V mutation in PSEN1. Stem cell research, 17(2), 285-288.
基因敲入
CRISPR-U™基因敲入iPSC细胞系：
通过核转染法将gRNA、Cas9和Donor共转入iPSC细胞中，进行药筛，药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序，筛选出敲入纯合的阳性克隆。敲入荧光报告基因的也可以通过观察荧光进行初步筛选。
敲入方案：
特定位点融合蛋白：
源井生物的细胞系基因编辑专家使用CRISPR-U™技术设计您的安全港基因敲入iPSC模型，生成满足您特定研究需要的细胞系模型。
基因定点过表达:
人类iPSC在hROSA26和AAVS1位点定点敲入感兴趣的基因，即可以避免片段在基因组随机插入，又可实现目标基因过表达。
源井生物的细胞系基因编辑专家使用CRISPR-UTM技术设计您的安全港基因敲入iPSC模型，生成满足您特定研究需要的细胞系模型。
应用案例：
通过构建以AAVS1位点为靶点的AAVS1-Cas9-sgRNA质粒和AAVS1-EF1α-F9 cDNA嘌呤霉素donor
载体，并将其导入iPSC。将F9
cDNA成功插入AAVS1位点的iPSCs分化为肝细胞，在培养上清中成功检测到人因子IX（hFIX）抗原和活性。最后，通过脾脏注射将肝细胞移植到非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷病（NOD/SCID）小鼠体内。
iPSC转染48小时后，用嘌呤霉素进行药物筛选。大多数iPSCs在药物选择后死亡，但少数存活下来。大约7天后，每个存活的iPSC的克隆都长得足够大，可以在两组（图a，b）中进行进一步的插入检测。从中挑选出6个克隆。如图c所示，用引物可在所有iPSC克隆中检测到1.3kb的片段；用另外一对引物可在iPSC克隆1、2、3、4和6中检测到468bp和4.9kb的片段，表明F9 cDNA杂合插入；在iPSC克隆5中只能检测到4.9kb的片段，表明F9 cDNA纯合插入。
参考文献：
Lyu, Cuicui, et al. "Targeted genome engineering in human induced
pluripotent stem cells from patients with hemophilia B using the
CRISPR-Cas9 system." Stem cell research & therapy 9.1 (2018): 92.
IPSC分化
由于人胚胎干细胞来源于早期胚胎而使其研究备受伦理争议，而且人胚胎干细胞来源的分化细胞进行异体移植时存在排斥反应，在一定程度上限制了其临床应用。iPSC来源于多种体细胞，可以诱导分化为不同种类的细胞用于科学研究。
源井生物的iPSC技术平台集中在分化的开发上，提高了从患者组织（如成纤维细胞）或现有的iPSC中产生具有功能的、成熟的肝细胞、神经细胞、T细胞、心肌细胞、造血干细胞和胰岛细胞。
源井生物的iPSC技术平台集中在分化的开发上，提高了从患者组织（如成纤维细胞）或现有的iPSC中产生具有功能的、成熟的肝细胞、神经细胞、T细胞、心肌细胞、造血干细胞和胰岛细胞。
实验流程
