CRISPR-U™基因敲除iPSC细胞通过核转染法将gRNA和Cas9转入iPSC细胞中,药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序验证,筛选出基因敲除的阳性克隆。
类型 | 小片段敲除 | 移码敲除 | 片段敲除 |
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方案 | 小片段敲除方案,gRNA设在外显子2两端的内含子中,敲除外显子编码碱基数为非3倍数,敲除后可造成移码。 | 移码敲除方案,gRNA设在外显子上,缺失的碱基数为非3倍数,敲除后可发生移码突变。 | 大片段敲除方案,将整个基因的编码序列敲除,达到大片段敲除的效果。 |
应用 | 通过基因失活研究基因功能 |
应用案例:
人T-iPSC分化的CD8αβ细胞在CD4/CD8双阳性分化过程中,通过T细胞受体(TCR)α链的重排而失去抗原特异性。使用CRISPR/Cas9敲除T-iPSCs中重组酶基因(RAG2)阻止了这种额外的TCR重排。含有稳定的TCR的CD8αβ-T细胞在异种移植肿瘤模型能有效地抑制肿瘤生长。这些方法有助于安全有效的T细胞免疫治疗。
gRNA和RAG2基因敲除的目标序列。阳性克隆在指定位置的双等位基因RAG2中有移码突变。
WT与RAG2基因敲除T-iPSCs对右旋异构体(dextramer)结合能力的比较。RAG2-/-T-iPSCs成功地分化为表达稳定TCR的CD8αβ细胞,而RAG2wt/wt-iPSC衍生的CD8αβ细胞有40%失去了抗原特异性。
参考文献:
Minagawa, Atsutaka, et al. "Enhancing T cell receptor stability in
rejuvenated iPSC-derived T cells improves their use in cancer
immunotherapy." Cell Stem Cell 23.6 (2018): 850-858.
CRISPR-U™基因点突变iPSC细胞
通过核转染法将
gRNA载体(含Cas9)和Donor共转入细胞中,gRNA和Cas9复合物造成靶位点DNA双链断裂后,iPSC细胞以外源携带目标点突变的Donor作为模板进行同源重组修复(HDR),将目标点突变重组到基因组靶位点。
gRNA载体携带抗性,可进行药筛,药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序,筛选出点突变纯合的阳性克隆。
应用案例:
细胞疾病模型建模
通过HDR,携带点突变序列的donor oligo (ssODN)替换WT对应的碱基。 细胞疾病模型建模
通过HDR,携带WT序列的donor oligo (ssODN)替换对应的突变碱基。 PSEN1基因A79V突变可引起阿尔茨海默症。研究表明,将阿尔茨海默症患者的体细胞诱导为多能干细胞(iPSC),然后通过用野生型序列替换点突变序列,修正突变的基因。通过研究患者的iPSC和修正后的iPSC,可以得知该突变对细胞表型的影响,从而深入研究该突变的病理性作用。
用于修复A79V-hiPSC点突变的gRNA序列和ssODN。
· A
突变位点附近的基因组序列:红色的T是需要被修正的核苷酸;黄色的是sgRNA识别位点,加粗的AA是Cas9的切割位点;粉红色的是正反向引物。
· B Donor oligo序列,
绿色的C是修正后的核苷酸。
iPSC中PSEN1基因的序列分析。
· A
点突变修正后的杂合子测序结果。
· B
点突变修正后的纯合子测序结果(T>C)。
参考文献:
Pires, C., Schmid, B., Petræus, C., Poon, A., Nimsanor, N., Nielsen, T.
T., ... & Freude, K. K. (2016). Generation of a gene-corrected isogenic
control cell line from an Alzheimer's disease patient iPSC line carrying
a A79V mutation in PSEN1. Stem cell research, 17(2), 285-288.
CRISPR-U™基因敲入iPSC细胞系:
通过核转染法将gRNA、Cas9和Donor共转入iPSC细胞中,进行药筛,药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序,筛选出敲入纯合的阳性克隆。敲入荧光报告基因的也可以通过观察荧光进行初步筛选。
敲入方案:
特定位点融合蛋白:
源井生物的细胞系基因编辑专家使用CRISPR-U™技术设计您的安全港基因敲入iPSC模型,生成满足您特定研究需要的细胞系模型。
基因定点过表达:
人类iPSC在hROSA26和AAVS1位点定点敲入感兴趣的基因,即可以避免片段在基因组随机插入,又可实现目标基因过表达。
源井生物的
细胞系基因编辑专家使用CRISPR-UTM技术设计您的安全港基因敲入iPSC模型,生成满足您特定研究需要的细胞系模型。
应用案例:
通过构建以AAVS1位点为靶点的AAVS1-Cas9-sgRNA质粒和AAVS1-EF1α-F9 cDNA嘌呤霉素donor
载体,并将其导入iPSC。将F9
cDNA成功插入AAVS1位点的iPSCs分化为肝细胞,在培养上清中成功检测到人因子IX(hFIX)抗原和活性。最后,通过脾脏注射将肝细胞移植到非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷病(NOD/SCID)小鼠体内。
iPSC转染48小时后,用嘌呤霉素进行药物筛选。大多数iPSCs在药物选择后死亡,但少数存活下来。大约7天后,每个存活的iPSC的克隆都长得足够大,可以在两组(图a,b)中进行进一步的插入检测。从中挑选出6个克隆。如图c所示,用引物可在所有iPSC克隆中检测到1.3kb的片段;用另外一对引物可在iPSC克隆1、2、3、4和6中检测到468bp和4.9kb的片段,表明F9
cDNA杂合插入;在iPSC克隆5中只能检测到4.9kb的片段,表明F9 cDNA纯合插入。
参考文献:
Lyu, Cuicui, et al. "Targeted genome engineering in human induced
pluripotent stem cells from patients with hemophilia B using the
CRISPR-Cas9 system." Stem cell research & therapy 9.1 (2018): 92.