干货丨OVCAR-3细胞培养和基因编辑Tips
OVCAR-3细胞,卵巢癌研究的“金牌选手”,凭借其对临床化疗耐药特性的高度模拟,成为探索肿瘤耐药机制、靶向治疗策略、免疫逃逸路径以及基因功能研究的“必修课”。从筛药到敲基因,从信号通路到细胞命运,它几乎无所不能,是肿瘤研究者案头的“标配神器”。如果你还没用过它,可能已经错过了一条通往研究前沿的快车道!今天,小源就带大家一起解锁 OVCAR-3 的使用秘籍:分享一些实用的细胞培养经验和高效的基因编辑技巧,助你科研事半功倍,稳稳拿下实验高分项!
细胞名称:OVCAR-3(人卵巢癌细胞)
细胞形态:上皮样,贴壁细胞
细胞培养条件:80%RPMI-1640+20%FBS+0.01mg/mL胰岛素
气相:空气,95%;二氧化碳,5%
温度:37℃
换液频次:2-3天/次
传代比例:1:2-1:3
细胞生长正常图片:细胞呈不规则上皮样,多为多边形或梭形,会呈现"铺路石样"排列
细胞生长状态差图片:细胞形态异常,如细胞体积变大,扁平化(如下图红框框起来处),细胞可能变得不规则,失去典型的铺路石样外观,出现空泡化等。
1) 准备:取7mL完全培养基于离心管中备用
2) 解冻:将细胞从干冰里取出,用镊子夹住盖子放入 37℃水浴中快速晃动(注意:水不能没过盖子),使其在1分钟左右完全融化,直至冰块融化至绿豆大小,停止水浴
3) 离心:将解冻后的细胞悬液转移至离心管中,1100rpm条件下离心4分钟,弃去上清液
4) 重悬与接种:用完全培养基重悬细胞,接种于合适大小的培养皿/瓶中
5) 培养:将培养皿/瓶置于37℃培养箱中培养,24小时后观察细胞状态及贴壁情况
1) 当细胞汇合度达到80%时可进行传代,传代时在超净台内弃去培养瓶里的培养液,加入5mLPBS洗涤细胞1-2次
2) 加入1mL胰酶,轻轻晃动瓶子并使胰酶完全浸过细胞,将培养瓶放入培养箱孵育 3-4分钟,待在显微镜下观察到大部分细胞变圆变亮,轻轻晃动培养瓶两侧有大部分细胞脱落时,立即终止消化
3) 加入2倍胰酶体积即2mL完全培养基终止消化,然后转移至15mL离心管中
4) 1100 rpm 室温离心 4 分钟,离心结束,弃去上清,加入完全培养基重悬细胞
5) 细胞按照1:2-1:4比例传代,传代第二天观察细胞状态
1) 收集细胞:按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中
2) 离心:1100rpm条件下离心4分钟,去掉上清
3) 重悬与冻存:用细胞冻存液重悬细胞,按每1mL冻存液含1×10^6个细胞/mL分配到冻存管中,标注好名称、代数、日期等信息
4) 降温与储存:将冻存管置于程序降温盒中,-80℃冰箱中过夜后转入液氮罐内保存
1. OVCAR-3培养时血清浓度需严格控制在20%,注意需要添加0.01mg/mL胰岛素
2. 消化时要控制好时间,尽量把细胞消化为单个细胞,操作中避免暴力吹打,需要轻柔操作
3. 接种密度不宜过低,建议每次传代比例为1:2-1:3,在细胞密度达到80-90%左右时进行传代,以维持细胞的健康状态。
4. 培养该细胞建议使用优质胎牛血清
1. 培养基和血清:确保使用正确的基础培养基和优质胎牛血清,血清比例对OVCAR-3细胞的培养有重要影响,血清过低可能会影响该细胞的生长。
2. 细胞培养环境:确认培养温度、湿度、气相条件是否正常
3. 避免使用过期或长时间存放的培养基,新鲜配制的完全培养基建议在两周内使用完毕
4. 细胞传代操作:细胞传代时,注意消化时间和胰酶浓度,避免因消化时间过长或过短导致的细胞损伤
1. 确认培养条件以及培养环境是否正确
2. 避免胰酶消化过度:合适的胰酶浓度和消化时间,避免用力吹打,造成细胞损伤
3. 增加血清浓度/选择高质量胎牛血清
4. 调整细胞密度:细胞密度过高会导致营养不足和代谢废物积累,从而加速细胞老化,应将细胞密度控制在适宜范围内
5. 添加生长因子,可以促进细胞增殖和分化,有助于改善细胞老化状态
6. 换低代次细胞
7. 通过挑选单克隆等方法,从老化的细胞群体中筛选出具有生长优势的单克隆细胞,进行纯化培养
1. 确保细胞状态良好,细胞处于对数生长期,此时细胞活性高,分裂旺盛,有利于转染效率的提升,细胞密度一般在70-80%之间
2. 注意细胞消化时间,避免过度消化,对细胞造成伤害
3. 实验过程中细胞要吹打成单细胞,避免细胞聚团
4. 细胞进行实验时活率≥80%
5. 电转法进行实验时控制好电转细胞量,电转后接种到合适的培养板里
6. 用电转法进行实验时要保证电转后细胞贴壁率≥70%
7. 用电转法进行转染时需控制好实验时间,电转全程不宜过长
8. 电转法转染24h需要及时用含有优质胎牛血清的完全培养基进行换液
9. 慢病毒法进行实验时要控制好感染前的细胞汇合度30-40%之间,不可过高
10. 选用病毒法进行正式实验前可进行预实验找到最合适的MOI;感染前添加助染剂Polybrene
11. 对于转染试剂使用前需要充分混匀保证其均匀性
1. 确保铺克隆实验前细胞状态正常,老化细胞少,建议控制细胞汇合度在70%左右
2. 铺克隆时细胞活率≥80%
3. 可先进行预实验找到合适的铺克隆梯度,避免单克隆占比太低
4. 细胞接种96孔板时需确保细胞分布均匀
5. 稀释细胞计数后结果最好落在1*10^6-2*10^6之间