干货丨OVCAR-3细胞培养和基因编辑Tips

干货丨OVCAR-3细胞培养和基因编辑Tips

OVCAR-3细胞，卵巢癌研究的“金牌选手”，凭借其对临床化疗耐药特性的高度模拟，成为探索肿瘤耐药机制、靶向治疗策略、免疫逃逸路径以及基因功能研究的“必修课”。从筛药到敲基因，从信号通路到细胞命运，它几乎无所不能，是肿瘤研究者案头的“标配神器”。如果你还没用过它，可能已经错过了一条通往研究前沿的快车道！今天，小源就带大家一起解锁 OVCAR-3 的使用秘籍：分享一些实用的细胞培养经验和高效的基因编辑技巧，助你科研事半功倍，稳稳拿下实验高分项！

细胞名称：OVCAR-3（人卵巢癌细胞）

细胞形态：上皮样，贴壁细胞

细胞培养条件：80%RPMI-1640+20%FBS+0.01mg/mL胰岛素

 气相：空气，95%；二氧化碳，5%

 温度：37℃

换液频次：2-3天/次

传代比例：1:2-1:3

细胞生长正常图片：细胞呈不规则上皮样，多为多边形或梭形，会呈现"铺路石样"排列

细胞生长状态差图片：细胞形态异常，如细胞体积变大，扁平化（如下图红框框起来处），细胞可能变得不规则，失去典型的铺路石样外观，出现空泡化等。

1) 准备：取7mL完全培养基于离心管中备用

2) 解冻：将细胞从干冰里取出，用镊子夹住盖子放入 37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化，直至冰块融化至绿豆大小，停止水浴

3) 离心：将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，1100rpm条件下离心4分钟，弃去上清液

4) 重悬与接种：用完全培养基重悬细胞，接种于合适大小的培养皿/瓶中

5) 培养：将培养皿/瓶置于37℃培养箱中培养，24小时后观察细胞状态及贴壁情况

1) 当细胞汇合度达到80%时可进行传代，传代时在超净台内弃去培养瓶里的培养液，加入5mLPBS洗涤细胞1-2次

2) 加入1mL胰酶，轻轻晃动瓶子并使胰酶完全浸过细胞，将培养瓶放入培养箱孵育 3-4分钟，待在显微镜下观察到大部分细胞变圆变亮，轻轻晃动培养瓶两侧有大部分细胞脱落时，立即终止消化

3) 加入2倍胰酶体积即2mL完全培养基终止消化，然后转移至15mL离心管中

4) 1100 rpm 室温离心 4 分钟，离心结束，弃去上清，加入完全培养基重悬细胞

5) 细胞按照1:2-1:4比例传代，传代第二天观察细胞状态

1) 收集细胞：按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中

2) 离心：1100rpm条件下离心4分钟，去掉上清

3) 重悬与冻存：用细胞冻存液重悬细胞，按每1mL冻存液含1×10^6个细胞/mL分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息

4) 降温与储存：将冻存管置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜后转入液氮罐内保存

1. OVCAR-3培养时血清浓度需严格控制在20%，注意需要添加0.01mg/mL胰岛素

2. 消化时要控制好时间，尽量把细胞消化为单个细胞，操作中避免暴力吹打，需要轻柔操作

3. 接种密度不宜过低，建议每次传代比例为1:2-1:3，在细胞密度达到80-90%左右时进行传代，以维持细胞的健康状态。

4. 培养该细胞建议使用优质胎牛血清

1. 培养基和血清：确保使用正确的基础培养基和优质胎牛血清，血清比例对OVCAR-3细胞的培养有重要影响，血清过低可能会影响该细胞的生长。

2. 细胞培养环境：确认培养温度、湿度、气相条件是否正常

3. 避免使用过期或长时间存放的培养基，新鲜配制的完全培养基建议在两周内使用完毕

4. 细胞传代操作：细胞传代时，注意消化时间和胰酶浓度，避免因消化时间过长或过短导致的细胞损伤

1. 确认培养条件以及培养环境是否正确

2. 避免胰酶消化过度：合适的胰酶浓度和消化时间，避免用力吹打，造成细胞损伤

3. 增加血清浓度/选择高质量胎牛血清

4. 调整细胞密度：细胞密度过高会导致营养不足和代谢废物积累，从而加速细胞老化，应将细胞密度控制在适宜范围内

5. 添加生长因子，可以促进细胞增殖和分化，有助于改善细胞老化状态

6. 换低代次细胞

7. 通过挑选单克隆等方法，从老化的细胞群体中筛选出具有生长优势的单克隆细胞，进行纯化培养

1. 确保细胞状态良好，细胞处于对数生长期，此时细胞活性高，分裂旺盛，有利于转染效率的提升，细胞密度一般在70-80%之间

2. 注意细胞消化时间，避免过度消化，对细胞造成伤害

3. 实验过程中细胞要吹打成单细胞，避免细胞聚团

4. 细胞进行实验时活率≥80%

5. 电转法进行实验时控制好电转细胞量，电转后接种到合适的培养板里

6. 用电转法进行实验时要保证电转后细胞贴壁率≥70%

7. 用电转法进行转染时需控制好实验时间，电转全程不宜过长

8. 电转法转染24h需要及时用含有优质胎牛血清的完全培养基进行换液

9. 慢病毒法进行实验时要控制好感染前的细胞汇合度30-40%之间，不可过高

10. 选用病毒法进行正式实验前可进行预实验找到最合适的MOI;感染前添加助染剂Polybrene

11. 对于转染试剂使用前需要充分混匀保证其均匀性

1. 确保铺克隆实验前细胞状态正常，老化细胞少，建议控制细胞汇合度在70%左右

2. 铺克隆时细胞活率≥80%

3. 可先进行预实验找到合适的铺克隆梯度，避免单克隆占比太低

4. 细胞接种96孔板时需确保细胞分布均匀

5. 稀释细胞计数后结果最好落在1*10^6-2*10^6之间

电转图: