先导编辑（Prime Editing）：精准基因治疗的革命性突破

先导编辑（Prime Editing）：精准基因治疗的革命性突破

在构建基因点突变细胞系时，科学家们已经开发了多种技术手段，例如RNP（核糖核蛋白）法可直接递送蛋白复合体且效率高，但需要结合电转设备）、单碱基编辑器（Base Editor）（适合实现特定类型的碱基置换）、质粒抗性筛选法（通过筛选抗性细胞群体提高成功率）以及近年来备受关注的先导编辑（Prime Editing）等。每种方法如同工具箱中的利器，拥有各自独特的优势与应用场景，科学家们需要根据项目目标灵活选择。今天，小源将为大家重点介绍近年来基因编辑领域颇受关注的一种方法——先导编辑（Prime Editing）！

先导编辑（Prime Editing,PE）由哈佛大学David Liu团队于2019年首次提出的一种“无断裂、可编程”的精准基因编辑技术。与传统CRISPR-Cas9系统依赖于DNA双链断裂（DSB）不同，先导编辑通过一种融合了Cas9 nickase（单链切口酶）与逆转录酶（RT）的蛋白复合体，在基因组中实现“搜索-替换”式的精准编辑，不仅大幅降低了脱靶率和染色体重排风险，还极大地拓展了编辑种类和范围：

1. 精准实现单碱基替换（不仅限于A>G或C>T）

2. 支持小片段的插入、缺失与定向编辑

3. 不引发大规模DNA损伤，安全性更高

4. 适配更广泛的细胞类型和应用场景（包括难编辑的细胞系）

Prime Editing打开了基因编辑的新纪元，尤其在疾病模型构建、细胞治疗开发、功能基因研究等领域，展现出令人兴奋的应用前景。

PE系统主要包含三个关键组件 ：

1.先导编辑引导RNA（pegRNA）：识别待编辑目标核苷酸序列，并编码用于替换目标序列的新遗传信息。pegRNA 由一个扩展的单向导RNA（sgRNA）构成，其中包含引物结合位点（PBS）和逆转录（RT）模板序列。在基因组编辑过程中，PBS 允许带切口的 DNA 链的 3' 端与pegRNA 杂交，而 RT 模板则作为合成编辑后遗传信息的模板。

2.Cas9 H840A切口酶与莫洛尼鼠白血病病毒（M - MLV）逆转录酶的融合蛋白：Cas9 H840A 切口酶是对Cas9酶进行改造所得，Cas9酶原本含有两个可切割DNA序列的核酸酶结构域，即切割非靶链的 RuvC结构域和切割靶链的HNH结构域。通过引入H840A替换（将第 840位的组氨酸替换为丙氨酸），使HNH结构域失活，此时只有RuvC结构域发挥功能，使得改造后的Cas9仅能在DNA上引入单链切口，故而称为切口酶。M - MLV逆转录酶则可从单链RNA模板合成DNA。

3.单向导RNA（sgRNA）：其作用是引导融合蛋白中的Cas9 H840A切口酶部分对未编辑的DNA 链进行切割。
编辑流程：

图1 PE的基本原理（Anzalone et al.,2019）

基因组编辑时，将pegRNA和融合蛋白转染到细胞中（通常借助载体将它们导入细胞）。融合蛋白对目标DNA序列进行切割，产生一个单链切口，暴露出3'- 羟基末端，该末端可起始对pegRNA中RT模板部分的逆转录过程，形成一个分支中间体，该中间体包含两条DNA链：一条3' 链含有新合成的（编辑后的）序列，一条5' 链含有未编辑DNA序列。随后，5' 链被结构特异性核酸内切酶或5' 外切核酸酶切割，使得3' 链能够进行连接，形成由一条编辑链和一条未编辑链组成的异源双链DNA。重新退火的双链DNA在编辑位点处存在核苷酸错配，细胞利用自身的错配修复机制对其进行校正，可能导致两种结果：一是将编辑链上的信息复制到互补链上，永久固定编辑；二是将原始核苷酸重新掺入编辑链，排除编辑。

先导编辑（Prime Editing, PE）在设计上进一步减少了对DNA双链断裂（DSB）的依赖，从而在一定程度上降低了染色体异常等潜在风险。得益于其独特的“搜索-替换”机制，PE技术能够覆盖约89%的已知致病突变，并支持多达12种类型的碱基转换及小片段精准编辑，拓展了基因修饰的多样性与精度，为精准医学与细胞模型构建提供了新的可能性。

表1.PE不同版本之间的区别

先导编辑技术凭借高效、精准和低脱靶率的特点，在多个领域有着广泛应用前景。

1. 疾病治疗

单基因遗传病治疗：苯丙酮尿症（PKU）由PAH基因突变导致，通过设计pegRNA引导Cas9切口酶结合，逆转录酶合成正常PAH基因序列并整合到基因组，在小鼠模型中成功纠正突变，恢复苯丙氨酸正常代谢，约40%的小鼠PAH酶活性显著恢复，血中苯丙氨酸浓度降至正常水平。镰状细胞贫血由β-珠蛋白基因突变引起，2023年4月，《Nature Biomedical Engineering》发表的研究显示，利用PE技术在患者造血干细胞中编辑突变基因，部分实验中成功编辑比例达20%-30%，为该病治疗提供了新思路。

眼科疾病治疗：莱伯先天性黑朦症是一种遗传性视网膜疾病，可致儿童失明或严重视力障碍。研究人员利用腺相关病毒载体将PE2递送至患病小鼠模型中，精准校正致病突变，改善了疾病表型，且未检测到脱靶编辑。实验中，约60%的治疗小鼠视网膜电图（ERG）反应幅度提升，视网膜功能明显改善，视觉功能有所恢复。这一成果为眼科遗传疾病治疗提供了新策略，相关研究发表于《Journal of Experimental Medicine》。

2. 基因功能研究

有研究对乳腺癌细胞系中的BRCA1基因进行PE编辑，成功构建BRCA1缺失细胞模型，约70%的细胞实现预期编辑，且在体外增殖和迁移能力上与未编辑细胞有显著差异。这一成果为肿瘤基因功能研究提供了重要实验依据。

3. 药物研发

在针对EGFR基因突变相关肺癌的研究中，利用PE技术构建携带EGFR敏感突变的细胞系，筛选出的新型靶向药物抑制率超80%，显著优于传统药物。此外，PE技术还可优化药物靶点，通过精准编辑改变靶点基因对药物的亲和力或敏感性，提升药物治疗指数，为药物开发提供新手段和研究方向

4. 农业育种

在水稻中，PE技术被用于编辑相关基因，成功培育出具有优良性状（如抗倒伏和增产）的植株。对水稻的SD1基因进行PE编辑后，约30%的编辑植株表现出显著的矮化和茎秆粗壮的抗倒伏性状，同时产量较野生型提高了10%-15%，为水稻品种改良提供了新途径。2025年2月，南京农业大学万永杰教授和张艳丽教授课题组在《Protein & Cell》期刊发表研究成果，成功利用升级后的核酸酶先导编辑器（uPEn）在湖羊中实现MSTN/PPARG双基因高效编辑，为培育生长性能更好、肉质更佳的湖羊新品种提供了可能。

图2.南京农业大学与南京大学合作开发出升级版PE工具（uPEn）

在传统基因编辑技术为生命科学研究与应用奠定坚实基础的背景下，先导编辑（Prime Editing, PE）作为一种无需依赖DNA双链断裂和供体模板的新型精准编辑工具，展现了广阔的应用前景。自PE1至PE7及其衍生策略不断发展，PE在编辑效率、精准性及操作灵活性方面持续优化，拓展了从疾病治疗、基因功能研究到药物开发与农业育种等多个领域的应用空间。展望未来，随着pegRNA设计、逆转录酶性能提升、DNA修复机制理解加深及递送技术（如纳米载体、靶向病毒载体）创新，PE有望进一步丰富基因组编辑工具箱，为生命健康与可持续发展的挑战提供有力支撑。

参考文献

[1] Anzalone, A. V., Randolph, P. B., Davis, J. R., et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature,2019,576(7785).
[2] Chen PJ, Hussmann JA, Yan J., et al. Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes. Cell. 2021 Oct 28;184(22):5635-5652.e29.
[3] Yan J, Oyler-Castrillo P, Ravisankar P., et al. Improving prime editing with an endogenous small RNA-binding protein. Nature. 2024 Apr;628(8008):639-647.
[4] Mao W, Wang P, Zhou L., et al. An upgraded nuclease prime editor platform enables high-efficiency singled or multiplexed knock-in/knockout of genes in mouse and sheep zygotes. Protein Cell. 2025 Jan 20:pwaf006.
[5] Chen PJ, Liu DR. Prime editing for precise and highly versatile genome manipulation. Nat Rev Genet. 2023 Mar;24(3):161-177.
[6] Everette KA, Newby GA, Levine RM., et al. Ex vivo prime editing of patient haematopoietic stem cells rescues sickle-cell disease phenotypes after engraftment in mice. Nat Biomed Eng. 2023 May;7(5):616-628.