CRISPR文库筛选不求人！源井独家奉上最全数据分析问题答疑合集

CRISPR文库筛选不求人！源井独家奉上最全数据分析问题答疑合集

CRISPR-Cas9文库筛选技术已成为功能基因组学研究的核心驱动力，能够精准破解基因功能并揭示其在细胞生理及疾病发生中的关键作用。然而，从高通量筛选实验设计到后续复杂的数据分析，研究者常常面临诸多挑战。本次小源将针对CRISPR筛选数据分析过程中最常见的12大问题进行深度剖析，提供切实可行的优化策略与解读指南，助力科研人员显著提升实验效率与结果可靠性。

通常建议单个样本的测序深度达到200X以上，其所需的测序数据量为“测序深度”*“文库覆盖度”*“sgRNA数”/“匹配率”，以人全基因组敲除文库A库为例，其所需测序数据量约为10G。

在做数据分析时，会先将测序所得reads与对应的CRISPR文库sgRNA列表进行匹配，即mapping率。CRISPR文库筛选结果分析过程是对匹配到文库中的序列进行分析，而未匹配的序列会被排除在外，因此较低的mapping率一般不会对分析结果产生明显的影响，但需要确保最终匹配到文库中的reads数能满足足够的测序深度（200x以上）,避免测序数据量较低导致的实验结果误差过大。

CRISPR/Cas9系统中的基因编辑效率受sgRNA序列本身的影响较大，不同的sgRNA介导的基因编辑效率差异很大，并且会出现部分sgRNA无编辑效率的情况。因此，为了增加CRISPR文库筛选结果的可靠性，建议适当增加针对每个基因所设计的sgRNA数量，以减少sgRNA介导的基因编辑效率对筛选结果的影响。

若基因没有显著富集一般更有可能是筛选压力过低，导致实验组未达到筛选的目的。可增加筛选压力、延长筛选时间，使得阳性细胞富集程度更高，差异更加明显。

阴性筛选指的是对实验组施加较弱的筛选压力，使得少量细胞死亡，关注的靶点位于这些死亡的细胞中，结合生信分析，在负向筛选的结果中寻找靶点；
阳性筛选则是对实验组施加较强的筛选压力，使得大量的细胞死亡，少数细胞对筛选压力耐受而存活，关注的靶点位于这些存活的细胞组，结合生信分析，在正向筛选的结果中寻找靶点。

判断筛选是否成功最理想的方式是设置已被明确的靶点基因,在CRISPR文库中添加对应的sgRNA作为阳性对照,通过评估阳性对照基因是否被富集来判断筛选是否成功。如果无明确的靶点，则可通过评估细胞杀伤效果、生信分析结果中sgRNA的LFC差异变化倍数等，判断筛选是否达到预期效果。

在使用RRA算法进行分析时，基因的LFC取值为对应sgRNA的LFC的中位数而非平均数。

RRA算法是一种综合排名算法，会根据一个基因的多个不同指标进行综合打分（即RRA score），通常排名越靠前的是靶基因的可能性就越高，但是无法明确地指征Rank排名前多少的基因是潜在的靶基因；LFC与p值联合筛选是生物学研究中常用的目的基因筛选方法，可设置特定阈值进行靶基因筛选，但是纳入分析的系数只有LFC和p-value两种筛选出的结果中可能假阳性基因占比更多。通常，我们更建议优先使用RRA Rank排名作为首要靶基因筛选方法；当然，在文献中，这两种靶基因的筛选方式均很常见。

目前最常用的分析工具是MAGeCk，包含RRA和MLE两种算法；其中RRA算法更适用于一个实验组一个对照组的分析，而MLE算法可进行多个不同实验组的联合分析。

如果是文库cell pool细胞，则说明 开展文库筛选前初始的sgRNA覆盖率不足 ，容易导致靶基因在筛选前就已经丢失，需重新构建CRISPR文库细胞。如果是筛选后实验组样本sgRNA丢失过多，则说明筛选压力较强，如果关注靶点位于存活/富集的细胞中，则筛选结果可信度较高；如果关注靶点位于死亡/丢失的细胞中，则筛选结果可信度较低，需降低筛选压力。

在CRISPR文库筛选中，流式分选通常用于筛选荧光强度前5-10%或后5-10%的细胞，以此达到对特定蛋白表达量高或低的细胞群的富集作用。通过生信分析正向筛选结果，识别被富集细胞群中的sgRNA的富集程度，以此来评估哪些基因被敲除/过表达可促进或抑制靶标蛋白的表达。值得一提的是，使用流式分选往往只能进行一轮富集，而且在分选过程中可能会由于电压不稳定、增益设置不当等问题导致实验误差，导致筛选结果中假阳性、假阴性结果占比较高。为了获得更加稳定的结果，建议进行多轮分选、增加初始细胞量等方法，以降低实验误差对筛选结果的干扰。

对于多个重复的样本，如果重复性较好（一般皮尔森系数大于0.8），建议多样本一起分析。如果重复性较差，可以考虑一对一分析，再结合韦恩图分析寻找多次实验共通靶点，以增加筛选结果可信度。

CRISPR筛选是一项高度复杂且协同性强的系统工程，涵盖sgRNA文库设计、病毒转导、细胞处理、测序数据预处理、归一化、统计分析及生物学解释等多个关键环节。任一环节的偏差都可能对最终结果产生系统性影响，影响筛选的准确性与可靠性。

小源系统深度梳理了CRISPR筛选中常见的技术问题与优化策略，涵盖文库覆盖度、比对率、筛选信号判读、统计模型选择与分析工具应用等核心内容。通过建立标准化分析流程与数据质控体系，可有效提升筛选结果的稳定性、降低假阳性/假阴性率，助力功能基因组学研究向更深层次发展。

源井生物依托自主研发的高效感受态细胞和独家Cell Pool标准化制备工艺，确保文库构建质量高、转化效率优，文库覆盖率＞99%、均一性＜10%。公司构建了多样化功能筛选平台，支持多表型体系及大规模细胞培养需求，配备专业技术团队保障实验一致性。基于专属的数据分析与管理平台，源井可为客户实现数据采集、清洗、分析与可视化的全流程自动化处理，精准满足不同科研需求。依托成熟的质量体系与全流程服务能力，源井生物为CRISPR筛选提供从文库构建到数据解读的一站式整体解决方案，为功能基因挖掘、靶点发现及疾病机制研究提供强有力的技术支撑。