源井基因编辑E.coli助力MMR sliding clamp模型研究新进展！

源井基因编辑E.coli助力MMR sliding clamp模型研究新进展！

DNA错配修复(MMR)是一种基因组复制后的修复系统，在提高DNA复制保真性、减少基因突变和维持基因组稳定性等方面具有重要作用。人类细胞中MMR相关基因的突变会导致MMR系统失活，使细胞突变率上升100倍以上，并与Lynch综合征、遗传性非息肉病性结直肠癌 (HNPCC)及一些散发性癌症相关。因此，深入探究MMR系统工作的分子机制具有重要的生理意义，可以为相关疾病的预防和治疗提供理论基础。

在E.coli的MMR系统中，MutS识别错配后会招募MutL形成复合物，再由MutL介导下游蛋白的激活，进行错配修复（图1）。从错配的识别，到特定位点的剪切，信号传递的过程需要同时具备高效性和特异性。

图1. DNA错配修复过程^[1]

目前，错配修复的起始模型有以下四种（图2），这些模型都认为错配信号是由MutS-MutL复合物进行传递的。而且，除sliding模型外，另外三种模型都认为MutL与DNA的相互作用在信号传递的过程中有重要功能。

图2. DNA错配修复起始模型^[2]

然而，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心刘珈泉课题组前期的工作发现MutL在结合ATP后会发生构象变化，在DNA上形成MutL sliding clamp并快速扩散（图3）。MutL sliding clamp的形成是信号传递的前提，然而它与DNA之间似乎并不存在持续的相互作用。

图3. MutL结构模型图

根据文献报导，MutL通过N端结构域中富含正电氨基酸的部位(positively charged cleft, PCC)与DNA发生相互作用。而且PCC突变会导致MMR系统效率下降、细胞突变率上升。为了探究MMR信号传递过程中的关键分子和PCC的功能，刘珈泉课题组通过单分子荧光成像技术和体外重构MMR系统，与俄亥俄州立大学Richard Fishel课题组合作在Nature Communications发表题为“MutS functions as a clamp loader by positioning MutL on the DNA during mismatch repair”的研究论文。该研究结果证明了MutS利用MutL PCC来促进MutL sliding clamp在DNA上的形成,从而传递错配信号的过程。

PCC突变导致MutL结合DNA能力减弱

通过序列对比，研究人员找到了PCC中保守的氨基酸，并对它们进行突变。实验结果显示，PCC突变会导致MutL结合DNA的能力减弱（图4）。

图4. MutL与DNA的相互作用^[3]

PCC突变导致MMR系统失活

为了进一步探究MutL结合DNA能力减弱是否会导致MMR系统失活，研究人员使用了E.coli的MutL基因敲除株（由源井生物提供）进行了体内互补实验。他们发现回补MutL PCC突变的基因并不能让敲除株的突变率恢复到正常水平，这说明了PCC突变会导致MMR系统失活。同时，单分子成像的结果说明了PCC突变导致MMR系统失活的原因是MutL突变体无法与MutS形成复合物（图5）。

图5. PCC突变导致MMR系统失活^[3]

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MutS利用PCC促进MutL sliding clamp的装载

为了进一步探究PCC突变对MutS-MutL复合物组装和后续MutL sliding clamp形成的影响，研究人员采用了溶液置换的上样法。首先，在低离子强度条件下部分恢复PCC的功能，然后将溶液环境置换成生理离子强度，观察MutL sliding clamp的形成。结果显示，MutS激活并利用了MutL PCC，与MutL组装成复合物后将MutL装载到DNA上形成MutL sliding clamp。

图6. MutS利用MutL PCC促进MutL sliding clamp的装载^[3]

MutS是错配特异性的clamp loader

过去，人们一直认为MutS招募MutL后会以复合物的形式进行错配信号的传递。然而，研究人员发现MutL sliding clamp的形成可以不依赖于MutS，而且能够激活下游通路。因此，MutS在MMR中的功能只是作为错配特异性的clamp loader，将MutL装载到DNA上。一旦MutL sliding clamp形成，将不再需要MutS参与MMR下游的修复过程。

图7. MutL sliding clamp激活MMR下游通路^[3]

该研究不仅证明了MutL sliding clamp才是MMR信号传递的关键分子，而MutS只是错配特异性的clamp loader，还解释了MutL PCC的功能，为DNA错配修复信号传递机制提供了新的见解。

参考文献：

[1] Fishel R. Mismatch repair. J Biol Chem. 2015 Oct 30;290(44):26395-403. doi: 10.1074/jbc.R115.660142. Epub 2015 Sep 9. PMID: 26354434; PMCID: PMC4646297.

[2] Ortega, Janice et al. “Mispair-bound human MutS-MutL complex triggers DNA incisions and activates mismatch repair.” Cell research vol. 31,5 (2021): 542-553. doi:10.1038/s41422-021-00468-y

[3] Yang, Xiao-Wen et al. “MutS functions as a clamp loader by positioning MutL on the DNA during mismatch repair.”Nature communications vol. 13,1 5808. 3 Oct. 2022, doi:10.1038/s41467-022-33479-3