如何利用基因编辑技术研究基因点突变

1. 编码区域

a. 沉默突变：尽管序列发生了变化，这种突变通常会导致整合进多肽链中的氨基酸没有发生变化，这种点突变对蛋白质的结构没有影响，也因此被称为沉默突变。

b. 错义突变：导致不同的氨基酸会被整合进多肽链中。错义突变的影响取决于突变后新的氨基酸与野生型氨基酸在化学上的差异。

c. 无义突变：是指将编码氨基酸的密码子（有义密码子）转换为终止密码子（无义密码子）。无义突变会导致合成出来的蛋白质会比野生型的要短，并且编码出来的蛋白通常不起作用。

2. 非编码区：在基因的非编码区内的突变实际上是可以影响基因的表达和功能的。

a. 内含子可能包含某些序列，这些序列会结合其他可转录的增强子或沉默子（但这些元件的不是基因所必需的包含），因此在这些区域中形成的突变是有可能影响基因的转录。

b. 内含子还包含非编码RNA的序列（如miRNA，lincRNA），这些序列可能会影响所在基因（和/或其他基因）的mRNA的翻译和稳定性。当突变改变这些RNA的加工或序列的时候，一定会改变基因产物的产生量。

c. 在剪接过程中，内含子会有更高级别的调节。当内含子中的剪接信号发生了突变（剪接因子结合的地方），这有可能会改变内含子这一调节功能。在这些区域中的突变可能导致产生差异剪接或截短的产物，而这些产物可能是不起作用的，甚至有了不同的功能。

d. 在翻译水平上，UTR参与调节蛋白质生产的活性，因此在UTR（非编码区）的突变可能会影响蛋白质的生产量。

1. Loss of function: 在野生型二倍体细胞中，基因有两个野生型等位基因，均有正常基因产物。但是在杂合子中，单个野生型等位基因可能也能提供足够的正常基因产物以产生野生型表型。在这种情况下，功能丧失性突变是隐性的。在某些情况下，细胞可以“上调”单个野生型等位基因的活性水平。因此在杂合子中的单个野生型等位基因的基因产物的总量是纯合野生型基因产物的一半以上。但是，某些功能丧失性突变也可以是显性的。在这种情况下，杂合子中的单个野生型等位基因不能像野生型一样提供细胞和生物体所需的基因产物量。因此，loss of function是指具有较弱功能或没有功能的基因产物（部分或完全失活）。

2. Gain of function: 其基因产物被改变而具有了新的分子功能或新的基因表达模式的一种突变。功能获得性突变几乎总是显性或半显性的。但是在杂合子的情况下，会表达新功能。因此功能获得性突变很可能像显性等位基因一样起作用并产生新的表型。

CRISPR/Cas9系统可以在许多生物体中进行针对基因组序列的编辑，并有望成为构建人类疾病模型的主要工具，如人多能干细胞和肿瘤细胞系。通过现代测序，CRISPR技术可以在各种细胞系中引入精确的点突变（纯合/杂合），并且能够构建人类疾病模型。这是有利于研究疾病治疗和基础基因组。多年来，细胞模型已被证明是可用于复制/模仿人类疾病。

CRISPR/Cas9可以高效地引入靶向双链断裂（DSB）。这些DSB可以通过使用DNA修复模板（例如引入的单链寡DNA核苷酸，即ssODN），通过同源定向修复（HDR）系统修复，从而完成特定突变的敲入。基于CRISPR的敲入基因组编辑框架允许研究人员选择性引入单等位基因和双等位基因的序列变化，以及引入杂合和纯合点突变，以构建致病性疾病模型。纯合点突变需要gRNA靶向接近目标突变的位置，而杂合点突变可以通过距离依赖性次优突变的掺入或通过使用混合修复模板来实现。CRISPR介导的敲入点突变对于功能获得（GOF）或功能丧失（LOF）研究非常有用。CRISPR介导的敲入点突变具有巨大的潜力，可以改善受此疾病影响的患者的预后能力，并最终可能为问诊和疾病靶向开辟新途径。

基于目前可用的基因工程工具，大部分研究人员愿意去开发针对人类疾病的细胞模型，以了解疾病发展的机制和潜在的治疗方法。

在二倍体生物体中，仅在基因的一个等位基因上发生的突变称为杂合突变。杂合就意味着一个人有两种不同版本的基因（一种遗传自一个亲本，另一种遗传自另一个亲本）。在由显性基因引起的疾病中，一个人只需要携带有一个致病基因拷贝就能表现出异常（患病）。由于基因优势性质，只要有一个受影响基因（从父母某一方继承）的人就基本都会患病。因此，如果是显性基因引起的疾病，那么杂合子也有可能表现出疾病。如果是隐性基因引起的疾病，那么杂合子可能不会发展成疾病或其影响较小。杂合点突变相关疾病——中心核肌病就是其中一个例子。

中心核肌病是一种以肌肉无力（肌病）和骨骼肌消瘦为特征的疾病。中心核肌病患者从出生到成年早期可以随时开始出现肌肉无力。随着时间的推移，肌肉无力的症状逐渐恶化，并可能导致运动技能如爬行或行走会比别人开发得要慢；运动过程中会出现肌肉疼痛；以及行走困难。随着肌肉萎缩和无力的情况变得更加严重，一些严重受影响的人可能需要轮椅的帮助。在极少数情况下，肌肉无力会随着时间而改善。中心核肌病通常是由DNM2，BIN1或TTN基因突变引起的。当中心核肌病是由DNM2基因突变引起的时，它以常染色体显性遗传方式遗传，这意味着每个细胞中DNM2基因改变的一个拷贝足以引起该疾病。DNM2相关的中心核肌病主要由杂合的单点突变引起。人类的CGG密码子编码位于465位氨基酸的保守精氨酸，但在Dnm2相关的中心核肌病患者中，位于465位氨基酸的CGG密码子变为TGG，编码色氨酸。

阿尔茨海默氏病（Alzheimer's disease, AD）是一种破坏性神经退行性疾病，占所有形式痴呆的50-75%。据统计，2015年全球约有4400万人被诊断患有阿尔茨海默氏病或相关痴呆症。每年报告约460万新增痴呆病例，预计到2030年阿尔茨海默氏病患者人数将增加近一倍。遗传因素可以解释许多影响阿尔茨海默氏病风险的变异，特别是家族性和早发性阿尔茨海默氏病（early-onset AD），其中大多数遗传变异与淀粉样β（amyloid-β）加工有关。早发性阿尔茨海默氏病是阿尔茨海默氏病的一种亚型，其发病年龄在65岁以前，但有几例患者在30或40多岁时发生AD。三种基因已被确定为早发性阿尔茨海默氏病的致病因子：淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP），早老素1（presenilin 1, PSEN1）和早老素2（presenilin 2, PSEN2）。阿尔茨海默氏病是杂合点突变相关疾病之一。

在同一基因的两个等位基因上发生的相同突变称为纯合突变。纯合点突变疾病的其中一个例子是Tay-Sachs病（TSD）。TSD是一种致命的常染色体隐性遗传疾病，最常见于儿童。TSD是由位于15号染色体上的HEXA（己糖胺酶A）基因突变引起的。如果没有位于15号染色体上的正常的HEXA，称为GM2神经节苷脂的脂肪物质或脂质会在细胞中异常积累，尤其在大脑的神经细胞中异常积累。这种持续的积累导致细胞的渐进性损伤并导致神经退行性疾病。HEXA基因中有近130个突变被报告会引起TSD及其变异，包括单碱基取代，小缺失，重复和插入剪接改变，以及复杂的基因重排和部分大重复。在德系犹太人中，94%-98%的患者是由c.1277_1278insTATC, c.1421 + 1 G > C and c.805 G > A (p.G269S).三种常见突变之一引起的。在非德系犹太人中也发现了c.805 G A（p.G269S）突变，以及在9号内含子中的剪接位点突变（c.1073+1 G A）。但目前并没有治疗或治愈的方法。

囊性纤维化（Cystic Fibrosis, CF）是一种隐性遗传疾病，在欧洲人后裔中最为常见。在美国，每3500名新生儿中就有1名患有囊性纤维化，而每30名白种人中就有1名是携带者。有许多不同的突变可以导致囊性纤维化，但最常见的突变是CFTR基因（囊性纤维化跨膜电导调节剂）中有三个核苷酸的缺失，导致氨基酸苯丙氨酸的丢失并导致蛋白质折叠错误。（请注意，这种缺失不是一种移码突变，因为彼此相邻的3个碱基被删除，链中所有其他氨基酸保持不变。）囊性纤维化的症状常伴有肺中粘稠的粘液和呼吸困难，咸汗，在某些群体还会有不育，和预期寿命缩短（在发达国家中约42-50岁）。