基因敲除

让基因编辑更简单
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基因敲除
基础原理
基因敲除（gene knockout）是1980s发展起来的技术，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。基因敲除是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组,整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。它是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。
基因敲除的方法
基因敲除技术的应用
  • 建立生物模型
    • 模型生物的建立对于基因功能、代谢等的研究非常重要。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠，家兔、猪、线虫、酵母和拟南芥等的基因敲除模型也常见于报道。
  • 疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗
    • 通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响。这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。
  • 免疫学中的应用
    • 同异源器官移植相似，异源的抗体用于人体时或多或少会有一定的免疫排斥，使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。而如果将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基因，那么将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产问题。
  • 改造生物、培育新的生物品种
    • 细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。它为定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持。
CRISPR-U™基因敲除细胞
  • 技术原理
  • 技术流程
  • 成功案例
  • 敲除方案&应用
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  • 技术专题
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  • 漫画
CRISPR-U™是源井生物自主研发的基因编辑技术（基于CRISPR / Cas9技术），CRISPR-U™技术比普通CRISPR/Cas9技术的基因切割效率更高，同时可以大幅度提升同源重组效率，轻松实现细胞和动物水平的基因敲除（KO）、基因点突变（PM）和基因敲入（KI）。利用CRISPR-U™的技术优势，源井生物已成功在超过100种细胞系上实现基因编辑。CRISPR/Cas9系统的原理是利用gRNA特异性识别靶序列，并引导Cas9核酸内切酶对靶序列的PAM上游进行切割，从而造成靶位点DNA双链断裂，随之利用细胞的非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）的方式对切割位点进行修复，实现DNA水平的基因敲除、敲入或点突变。
独家创新技术，基因编辑效率提升10倍；

独家创新技术，基因编辑效率提升10倍；

超过100种细胞基因编辑成功案例；

超过100种细胞基因编辑成功案例；        

轻松实现基因敲除，基因点突变和基因敲入；

轻松实现基因敲除，基因点突变和基因敲入；

承诺项目失败全额退款，成功保障安全无忧。

承诺项目失败全额退款，成功保障安全无忧。

服务流程及质量控制
内分泌系统
人乳腺癌细胞MDA-MB-231
人乳腺癌细胞MDA-MB-468
人乳腺癌细胞MDA-MB-453
人乳腺癌细胞MDA-MB-436
人乳腺癌细胞ZR-75-1
人正常乳腺细胞MCF10A
小鼠乳腺癌细胞4T1
人胰腺癌细胞PANC-1
人胰腺癌细胞Capan-2
人乳腺癌细胞MCF7
人乳腺导管癌细胞BT-474
人乳腺腺癌细胞SK-BR-3
人转移胰腺腺癌细胞AsPC-1
人胰腺癌细胞MIA PaCa-2
人前列腺癌细胞PC-3
人前列腺癌细胞LNCaP
人前列腺癌细胞VCaP
小鼠胰腺腺泡细胞266-6
人原位胰腺腺癌细胞BxPC-3
人乳腺管癌细胞T-47D
生殖系统
人宫颈癌细胞HeLa
人宫颈癌细胞HeLa 229
人子宫颈鳞癌细胞SiHa
小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3
仓鼠卵巢细胞亚株CHO-K1
人卵巢癌细胞SK-OV-3
人卵巢癌细胞OVCAR3
小鼠睾丸间质细胞TM3
消化系统
人结肠癌细胞株HCT116
人结肠癌细胞SW480
人结肠癌细胞SW620
人结肠癌细胞HT-29
人结肠癌细胞LoVo
人结肠腺癌细胞RKO
人结肠癌细胞COLO 205
小鼠结肠癌细胞MC38
小鼠结肠癌细胞CT26.WT
人结直肠腺癌上皮细胞DLD-1
人结直肠腺癌细胞NCI-H716
人结直肠腺癌细胞Caco-2
人结肠腺癌肺转移细胞T84
人肝癌细胞Hep G2
人肝癌细胞 Hep3B
人肝癌细胞HuH-7
人肝癌细胞SNU-387
人肝胆管癌细胞RBE
人胃癌细胞(HGC-27)
人胃癌细胞SGC-7901
人胃腺癌细胞AGS
人食管鳞癌细胞KYSE-150
人食管鳞癌细胞KYSE-30
人肾透明细胞腺癌细胞786-0
非洲绿猴肾细胞Vero
循环系统
人阴户平滑肌肉瘤细胞
大鼠心肌细胞H9C2
人冠状动脉内皮细胞株HCAEC
小鼠成肌细胞C2C12
血液和淋巴系统
小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7
人单核细胞白血病细胞THP-1
大鼠嗜碱性细胞白血病细胞RBL-2H3
人原髓细胞白血病细胞HL-60
人白血病T淋巴细胞Jurkat, Clone E6-1
人慢性髓原白血病细胞K-562
人组织细胞淋巴瘤细胞U-937
人急性非B非T淋巴细胞白血病Reh
人弥漫大B淋巴瘤细胞U2932
弥漫大B细胞淋巴瘤细胞OCI-LY3
骨、关节、软组织、皮肤系统
人骨肉瘤细胞MG-63
人骨肉瘤细胞U-2 OS
人纤维肉瘤HT1080
人恶性黑色素瘤细胞A-375
人黑色素瘤细胞M14
小鼠皮肤黑色素瘤细胞B16-F10
小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag14
泌尿系统
人膀胱癌细胞TCCSUP
人膀胱癌细胞5637
人膀胱移行细胞癌细胞T24
人胚肾细胞HEK293
人胚肾细胞(293衍生）
人胚肾细胞293T
人前列腺癌细胞22RV1
狗肾细胞MDCK(NBL-2)
呼吸系统
人肺癌细胞A549
人肺癌细胞Calu-1
小鼠肺癌细胞LLC
人肺鳞癌细胞NCI-H226
人非小细胞肺癌细胞NCI-H1299
人非小细胞肺癌细胞HCC827
人小细胞肺癌细胞H69AR
人正常肺上皮细胞BEAS-2B
人支气管上皮细胞16HBE
人咽鳞癌细胞FaDu
仓鼠肺细胞V79
脑和神经系统
人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH
小鼠神经母细胞瘤细胞Neuro-2a
人胶质瘤细胞U251
大鼠胶质瘤细胞C6
小鼠胶质细胞GL261
人脑星形胶质母细胞瘤U-87 MG
小鼠颅顶前骨细胞亚克隆MC3T3-E1 Subclone 14
永生化人脑微血管内皮细胞hCMEC/D3
小鼠海马神经元细胞系HT22
眼耳鼻喉口腔系统
大鼠穆勒细胞rmc-1
人鼻咽癌细胞C666-1
鼻咽癌细胞cne2z
人鼻咽癌细胞CNE1
敲除方案Knockout Strategies
源井生物根据客户需求，结合靶基因的情况进行基因敲除方案设计。
小片段敲除方案小片段敲除方案

gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

移码敲除方案移码敲除方案

gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。                                

大片段敲除方案大片段敲除方案

将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。

应用Knockout Strategies
中国仓鼠卵巢（CHO）细胞被用作生物工厂，用于生产一系列重组治疗蛋白，包括单克隆抗体和Fc融合蛋白。宿主细胞蛋白（HCP）是必须从治疗制剂中去除的杂质，因为它们具有潜在的免疫原性风险。虽然在典型的下游净化过程中，大多数HCP杂质被有效去除，但清除少量存在的HCP仍然是一个挑战。利用CRISPR/Cas9系统建立Anxa2和Ctsd基因敲除CHO细胞系，并证实了细胞裂解液中HCP完全消除。在培养过程中，所有的基因敲除细胞系都显示出与野生型对照相似的生长和活力。因此，敲除非必需基因可以减少重组治疗蛋白生产中HCP的污染。
（a）sgRNA打靶Anxa2基因的4号外显子。对序列进行双向分析。
（a）sgRNA打靶Anxa2基因的4号外显子。对序列进行双向分析。
（b） sgRNA打靶Ctsd基因2号外显子。对序列进行双向分析。
（b） sgRNA打靶Ctsd基因2号外显子。对序列进行双向分析。
用SDS-PAGE和WB分析鉴定CHO基因敲除细胞株的蛋白表达。
用SDS-PAGE和WB分析鉴定CHO基因敲除细胞株的蛋白表达。
（a） Anxa2基因敲除细胞系。
（b） Ctsd基因敲除细胞系。细胞培养上清液（47μg蛋白）和细胞裂解液（20μg蛋白）经4-20%SDS-PAGE分析。
CBB染色检测总蛋白。利用各自的捕获和检测抗体对每个蛋白质进行WB分析。星号表示非特定波段。双星号表示组织蛋白酶D的片段
在蛋白质表达分析中，没有观察到CHO-K1（WT）细胞系中的细胞培养上清液中的膜联蛋白A2和组织蛋白酶D。对贴壁的CHO-K1细胞进行静态培养，在培养过程中没有物理应力诱导细胞裂解，这表明CHO细胞分泌的这些蛋白质数量相当少。此外，在对Anxa2和Ctsd基因敲除细胞系的蛋白质表达分析中，没有观察到任何截短的HCP。
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CRISPR-B™基因敲除微生物
  • 技术介绍
  • 技术流程
  • 微生物种类
  • 促销活动
  • 技术专题
  • 新闻
Red/ET重组系统是微生物基因编辑最经典的方法，可以实现对DNA分子的敲除、点突变、敲入等多种修饰。该技术已被广泛地用于基因组DNA，如细菌人工染色体、大肠杆菌染色体等的遗传修饰研究以及基因工程药物的研究和开发中。但如何提高基因重组和编辑效率，一直是微生物基因编辑的研究热点，直到CRISPR/Cas9技术的出现，给微生物基因编辑带来一线曙光。
CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。近些年，由于CRISPR-Cas9基因编辑技术操作简单，基因编辑效率高被广泛应用，是目前用于基因编辑最前沿的方法。
CRISPR-B™是源井生物在基于Red/ET重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统基础上，通过自主研发优化基因编辑载体和基因编辑流程，在基因编辑效率和准确性均远高于传统方法的一项创新性技术。该技术可以广泛应用于细菌和真菌的基因编辑。
技术优势
基因编辑效率和重组效率是传统技术的20-30倍以上；

基因编辑效率和重组效率是传统技术的20-30倍以上；

无痕基因编辑技术，安全有保证；

无痕基因编辑技术，安全有保证；

应用范围广泛，包括基因敲除，基因点突变和基因敲入；

应用范围广泛，包括基因敲除，基因点突变和基因敲入；

可以同时实现多基因敲除的需求；

可以同时实现多基因敲除的需求；

（1）构建 CRISPR-B™细菌系列载体
CRISPR-B™ 系列载体
CRISPR-B _CR 表达Cas9核酸酶和Red重组系统的酶
CRISPR-B _G 表达靶基因的gRNA
CRISPR-B _D 一段DNA修复模板
（2）电转及制备稳转CRISPR-B _CR的感受态
· CRISPR-B _CR电转到细菌中，菌落PCR鉴定CRISPR-B _CR是否成功转入。
· 并将成功转入CRISPR-B _CR的菌株再制成电转感受态细胞。
（3）导入CRISPR-B_G及CRISPR-B _D进行打靶
将打靶载体CRISPR-B_G及CRISPR-B _D修复模板电转进稳转CRISPR-B _CR的感受态菌株中，CRISPR系统与Red重组系统共同作用对细菌基因组进行编辑。
（4）挑取单克隆进行PCR及测序鉴定，将CRISPR-B™质粒消去，获得敲除阳性克隆菌株。
技术流程
基因编辑细菌：源井生物利用CRISPR-B™技术通过电转的方法将CRISPR-B™系列载体导入细菌中，对细菌进行基因编辑，可实现细菌的敲除，点突变或敲入。
传统的基因敲除技术存在后期筛选工作量大（周期），重组效率低，残留loxP或FRT位点等缺点。CRISPR-B™技术作为一种高效的基因组编辑技术，具有操作简单、靶向性强、脱靶率低、无痕等诸多优势。
CRISPR-B™技术可编辑的细菌（节选）:
icon1
部分革兰氏阳性菌

· 金黄色葡萄球菌

· 枯草芽孢杆菌

· 乳酸菌（嗜热链球菌）

icon1
大多数革兰氏阴性菌

· 大肠杆菌

· 沙门氏菌


· 绿脓杆菌

更多的基因编辑细菌种类，请咨询源井生物
基因敲除病毒
  • 基因敲除慢病毒
  • 基因敲除腺相关病毒
  • 促销活动
  • 新闻
慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷1型病毒）为基础，使用疱疹病毒VSVG 外壳蛋白发展起来的工具载体。其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。慢病毒具有感染谱广泛特点，并且可以有效感染分裂和非分裂细胞。一经感染宿主细胞，慢病毒即利用反转录酶将其RNA转录成双链DNA，随后永久的整合到宿主细胞的染色体中，实现长时间稳定表达。 此外，慢病毒免疫原性低，不易造成免疫反应，所以现在慢病毒系统除了被广泛应用到各种细胞系的基因敲除/敲入、基因过表达、RNA干扰、microRNA研究，还大量应用于活体动物实验中。
产品规格Product Specs
规 格 交付标准 周 期 应 用
标准规格病毒 1*10^8 TU 2-3周 用于细胞转导
大包装规格病毒 1*10^9 TU 2-3周 用于细胞转导
纯化病毒 1*10^9 TU 2-3周 用于体内注射
服务流程及质量控制：

基因敲除慢病毒
源井生物构建慢病毒敲除载体并包装为慢病毒，细胞感染慢病毒后，可稳定表达gRNA和Cas9蛋白，达到敲除靶基因的目的。
基因敲除慢病毒载体选择:
YKO系列载体 载体名称 荧光抗性
慢病毒YKO系列载体 YKO-LV001-single-gRNA EGFPv/mCherry可选,Puro/Neo可选
YKO-LV001-dual-gRNA EGFPv/mCherry可选,Puro/Neo可选
慢病毒Cas9载体 YCas-LV001 EGFPv
YCas-LV002 Hygro
Cas9蛋白长达4kb，受慢病毒外源插入片段限制，通常将gRNA与Cas9分开包装慢病毒，再使用2种慢病毒共同感染宿主细胞。
腺相关病毒( adeno-associated virus，AAV) 是一类细小病毒，基因组为单链DNA，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。通常需要腺病毒或疱疹病毒帮助其在体内复制扩增。重组腺相关病毒（recombinant AAV, rAAV）是利用AAV2 型基因组与不同血清型的衣壳蛋白基因组结合产生的混合体病毒载体，可将目的基因的CDS 区序列或者RNAi 干扰序列插入rAAV 表达质粒中，包装病毒后感染细胞完成对目的基因的操作。腺相关病毒具有感染温和，免疫原性小，长效稳定表达的特点，主要应用于动物体内注射。
源井生物提供的腺相关病毒颗粒经过超速离心纯化，并通过qPCR对病毒基因拷贝进行滴定。腺相关病毒的滴度在10^12~10^13GC/ml，可以满足各类整体实验的使用要求。
不同血清型的AAV组织感染嗜亲性各不相同，表现出一定的器官靶向特异性。
下表列举了不同的AAV血清型及对应的组织亲和性:
血清型 组织亲和性
AAV1 SM,CNS,lung,retina,pancreas,heart,liver
AAV2 SM,SNS,liver,kidney,retina
AAV3 SM
AAV4 CNS,retina,lung,kidney
AAV5 SM,CNS,lung,retina
AAV6 SM,heart,lung,adipose,liver
AAV7 SM,retina,CNS,liver
AAV8 SM,CNS,retina,liver,pancreas,heart,kidney,adipose
AAV9 SM,lung,liver,heart,pancreas,CNS,retina,testes,kidney
AAVrh10 SM,lung,liver,heart,pancreas,CNS,retina,kidney
AAVPHP.B CNS
AAVDJ/8 SM, liver, CNS, retina
AAVPHP.S PNS
AAVPHP.eB CNS（stronger than AAVPHP.B）
基因敲除腺相关病毒
源井生物构建基因敲除腺相关病毒载体并包装为腺相关病毒，经过超速离心纯化后，可用于动物定位注射和整体注射实验。细胞感染腺相关病毒后，可稳定表达gRNA和Cas9蛋白，达到敲除靶基因的目的。
基因敲除腺相关病毒载体选择：
YKO系列载体 载体名称 荧光抗性
腺相关病毒YKO系列载体 YKO-AAV001-gRNA EGFPv
YKO-AAV002-gRNA mCherry
腺相关病毒由于病毒包装范围限制可选用SaCas9蛋白，gRNA和SaCas9蛋白构建在同一病毒上可提供转染效率。
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基因敲除载体
  • 技术原理
  • 敲除方案
  • 敲除载体分类
  • 促销活动
  • 新闻
CRISPR/Cas9系统是一种原核生物的免疫系统，是细菌用来抵抗病毒和外源质粒入侵的一种防御机制。目前最成熟且应用最广的是Type II的CRISPR/Cas9系统，其原理是利用gRNA特异性识别靶序列，并引导Cas9核酸内切酶对靶序列的PAM上游进行切割，从而造成靶位点DNA双链断裂，随之利用细胞的非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）的方式对切割位点进行修复，实现DNA水平的敲除、敲入或点突变。
敲除方案Knockout Strategies
源井生物根据客户需求，结合靶基因的情况进行敲除方案设计。
小片段敲除方案小片段敲除方案

gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

移码敲除方案移码敲除方案

gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。

大片段敲除方案大片段敲除方案

将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。

基因敲除载体分类Classification of knockout gRNA plasmids
源井生物研发的基因敲除系列YKO载体，包括慢病毒载体、普通载体、腺相关病毒载体等，可广泛应用于体外或体内研究。
YKO系列载体 载体名称 荧光抗性
慢病毒YKO系列载体 YKO-LV001-single-gRNA EGFP/mCherry可选，Puro/Neo可选
YKO-LV001-dual-gRNA EGFP/mCherry可选，Puro/Neo可选
普通YKO系列载体 YKO-RP001-single-gRNA EGFP/mCherry可选，Puro/Neo
YKO-RP001-dual-gRNA EGFP/mCherry可选，Puro/Neo可选
腺相关病毒YKO系列载体 YKO-AAV001-single-gRNA EGFP/mCherry可选
YKO-AAV001-dual-gRNA EGFP/mCherry可选
单gRNA载体
可应用于移码或片段敲除的方案中，设计2-3个gRNA同时转染细胞， 可提高敲除效率，轻松实现基因敲除。
双gRNA载体
可应用于大片段基因敲除的方案中，设计dual-gRNA构建在一个载体上， 转染细胞，可大大提高细胞转染效率。
更多
敲除方案Knockout Strategies
源井生物根据客户需求，结合靶基因的情况进行基因敲除方案设计。
小片段敲除方案小片段敲除方案

gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

移码敲除方案移码敲除方案

gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。                                

大片段敲除方案大片段敲除方案

将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。

应用Knockout Strategies
中国仓鼠卵巢（CHO）细胞被用作生物工厂，用于生产一系列重组治疗蛋白，包括单克隆抗体和Fc融合蛋白。宿主细胞蛋白（HCP）是必须从治疗制剂中去除的杂质，因为它们具有潜在的免疫原性风险。虽然在
基因敲除斑马鱼
  • 技术原理
  • 技术应用
源井生物采用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼进行基因敲除，CRISPR/Cas9系统的工作原理是crRNA（CRISPR-derivedRNA）通过碱基配对与tracr-RNA（trans-activatingRNA）结合形成tracrRNA/crRNA复合物，该复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA，以引导Cas9对DNA特点位点的切割。 Cas9蛋白具有两个核酸酶结构域，NHN（切割与crRNA互补的链）和RuvC（切割非互补链），可以分别切割DNA两条单链，造成DNA双链断裂，触发机体紧急修复。DNA双链断裂的修复，包括同源介导的修复（Homology Directed Repair, HDR）和非同源末端连接（Non homologous End Joining，NHEJ）两种。其中，NHEJ修复极易出现错误，导致碱基的缺失或插入，致使目的基因移码失活，从而达到基因敲除的目的。
DNA双链断裂后的修复
技术优势
源井生物技术团队拥有多年的基因编辑经验，成功率高，周期短，售后服务完善。
斑马鱼作为模式动物，具有以下诸多优势：
1. 斑马鱼实验为整体动物研究，相比体外细胞实验，更能模拟一些复杂的生物过程。
2. 斑马鱼个体小，繁殖能力强，产卵量大，利于统计分析，适用于高通量研究。
3. 斑马鱼全基因组测序已经完成，且与人类基因相似度高，其基因编辑方法也已非常成熟。
4. 斑马鱼胚胎发育迅速，胚胎较大，突出且透明，还可以在母体外发育，便于进行多种操作，且易于观察，研究结果直观。
5. 斑马鱼项目周期短，成本低。
6. 斑马鱼实验伦理风险比较低，研究可以快速开展。
中国总部400-688-9033
美国办事处855 777 3210
欧洲办事处800 3272 9252
亚太联系方式001 800 3272 9252

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