小源真传 | Western Blot（WB）操作笔记

小源真传 | Western Blot（WB）操作笔记

Western Blot（WB）作为研究蛋白表达的经典技术，在分子生物学实验中占据着举足轻重的地位。尽管原理清晰、步骤明确，但真正能跑出漂亮、清晰、重复性强的条带，却往往需要经验的积累与技巧的沉淀。小源根据在实验室多年的WB实操经验，归纳整理出若干关键细节与操作建议，希望能为正处在“条带焦虑”中的你提供一点实用参考。

在初次尝试检测某一蛋白时，往往缺乏关于其表达水平的基础信息。此时，务必以提高检测成功率为首要目标。在蛋白提取阶段，可以适当减少裂解液体积，以提高目标蛋白浓度；上样时适当增加样品量，一抗浓度亦可上调，显影时间延长，以便尽可能观察到条带。在此过程中，建议尽可能控制其他变量（如转膜电压、封闭液类型等），将注意力集中于“是否表达”这一问题。一旦获得初步结果，再依据条带清晰度和背景强弱，反向调整抗体浓度、封闭方式与孵育时间。切忌“照方抓药”，更应根据实验目的与样本特性灵活调整。

当进行样本间表达水平比较时，确保各孔上样蛋白量一致至关重要。传统方法要求通过BCA或Bradford法建立标准曲线、测定浓度、计算上样体积，这一过程虽然准确但颇为繁琐。实际操作中，采用简化方案：使用酶标仪直接读取裂解液的吸光度（例如OD562或OD595），以吸光度近似反映蛋白浓度，再据此调整体积。由于WB关注的是相对表达量，只要对比组间浓度基本一致，便能满足实验需求。尤其在实验初期摸索阶段，这一方法既节省时间又便于操作。

新手最容易忽视的一个细节便是膜与胶的放置方向。需牢记，PVDF膜有正反面，而胶无方向性。转膜时，电流方向应为：从胶穿过膜至下电极。操作时膜靠近正极，胶靠近负极，以确保目标蛋白按正确方向转移。同时，为防止后续孵育及显影步骤中“迷失方向”，建议在膜的一角剪去小块作为标记，或将Marker置于两侧而非中部。这样即使翻转多次，也能迅速辨别上样顺序，避免“镜像错觉”。

蛋白电泳完成后应尽快转膜，切忌将胶长时间置于电泳槽或空气中。此阶段蛋白尚未被固定，易发生扩散，尤其影响小分子蛋白的迁移精度。若暂时无法立即转膜，可将胶置于含20%甲醇的转膜缓冲液中暂存，实现初步固定。进一步建议：蛋白提取后尽量在冰上操作，直至加入loading buffer并煮沸变性完成。这一过程中尽量连贯完成，以减少蛋白降解。通俗理解，如同打碎的鸡蛋，需尽快“煮熟”再冷藏，避免变质。

封闭的目的是阻止抗体与膜上非特异位点结合。常用封闭液包括脱脂奶粉（5%）和BSA（3%）。二者差异在于：奶粉含杂蛋白多，成本低，适用于大多数情况；BSA纯度高，背景干净，适合用于检测磷酸化蛋白等对背景干扰敏感的实验。因此，推荐策略为：一般蛋白优先选用奶粉；如遇非特异性条带或背景偏高，可更换为BSA试验效果。

若一张膜上需检测多个蛋白，可依据分子量参考Marker位置剪成若干小段，分别孵育不同抗体，以提高效率、节约抗体用量。若目标蛋白分子量相近，无法物理切割，也可尝试“二次孵育”：先检测表达弱的目标蛋白，显影后使用抗体洗脱液（如0.1M Glycine, pH 2.5）洗去一抗与二抗，再检测表达量高的蛋白。但须注意，洗脱过程中可能导致膜上部分蛋白表位丢失，影响后续检测，使用时需权衡利弊。

为避免抗体液体积过大造成浪费，建议采购抗体孵育槽（通常为窄条形塑料槽，容量在5–10ml之间），每次仅需极少体积即可完成整张膜的孵育。若实验频率较高，长期计算下来可节省大量抗体成本，尤其适用于价格昂贵的进口抗体。此类耗材在电商平台易于购买，价格合理，建议实验室常备。

市场上常见的内参抗体（如β-Actin、GAPDH）常有HRP直标版本可选，省去了二抗孵育步骤。实验初期用于检测上样一致性尤为高效：一抗孵育后直接显影，快速判断样品是否均一。如内参表达量差异明显，说明蛋白浓度或上样量需重新调整，此时目的蛋白检测可暂缓进行，避免浪费贵重抗体资源。

WB工作量大、步骤多，适当的预处理与物料储备可极大提升效率。推荐在工作高峰期一次性配制多块电泳胶（封膜保存，置于4℃可保存约一周），同时预备足量Running buffer、转膜缓冲液等常用溶液。这样做的最大好处是：当灵感突至或有突发任务时，无需从零开始准备，可直接进入实操阶段，提高实验响应速度，提升整体节奏感。

Western Blot不仅是一项技术，它也是科研中极具“个性化”与“人文气息”的一环。它对细节的关注、对习惯的积累，往往决定了实验结果的成败。希望小源的这份经验总结，能帮助你少走弯路，多得结果；希望你你跑出的每一道条带，都清晰、稳定、可重复。

如果你正在摸索WB，如果你正在因“跑不出条带”而抓头，不妨收藏这篇文章。也欢迎咨询交流。另外，源井生物提供多种基因敲除细胞模型，客户可根据实验需求自主决定是否进行WB验证，灵活控制实验节奏，真正实现按需使用、按效选型。