战胜新冠疫情的有力武器——vero细胞系

Vero细胞又称为绿猴肾细胞，是一种非整倍性的非洲绿猴（属名：Chlorocebus）肾细胞系，1962年日本千叶大学的安村美博分离正常成年非洲绿猴的肾脏上皮细胞并获得该细胞系。Vero细胞是连续的非整倍性细胞系，这意味着它的染色体数目异常，而作为连续细胞系，Vero细胞可以经过许多分裂周期而不老化。Vero细胞的干扰素分泌功能出现缺陷，与正常的哺乳动物细胞不同，它们在被病毒感染时不会分泌干扰素α/β。然而，它们仍然具有干扰素-α/β的受体，因此当将重组干扰素添加到其培养基中时，它们仍然可以作出反应。目前Vero细胞被广泛应用于病毒感染分子机制的研究、疫苗及重组蛋白的生产，并被看作是培养流感疫苗和研究病毒感染分子机制的理想细胞模型^[1]。WHO批准其作为疫苗生产细胞，并建议将其作为流感疫苗生产的替代基质。

Vero细胞系在限定代次内被认为是非致瘤性的，因此可用作研究疫苗的基质。2005年，Vero细胞被世界卫生组织批准，可用于生产人类疫苗的细胞系。Vero细胞已用于生产预防小儿麻痹症疫苗，狂犬病疫苗和ACAM200 天花疫苗等^[2]。

Vero细胞系被分离后又衍生出几种亚细胞系，例如 Vero81、Vero76和VeroE6。基因组分析表明，这些细胞起源于一种雌性的非洲绿猴。由于Vero 细胞系可以无限传代，从而可用于广泛的细胞特性和大型细胞库的创建^[3]。

Vero 细胞干扰素表达不足被认为是其对许多病毒都很敏感的原因之一，其中包括猿猴空泡病毒、麻疹病毒、风疹病毒、节足动物携带性病毒及腺病毒等；后来被发现也容易感染细菌毒素，包括白喉毒素、不耐热肠毒素和志贺氏样毒素等。它们在感染病毒后不分泌信号肽干扰素，因此细胞的抗病毒防御机制受损[3]。这一特性让Vero细胞被广泛应用于病毒学、细菌学、寄生虫学和毒理学^[3]。

严重急性呼吸综合征冠状病毒-2（SARS-CoV-2）是2019年新冠病毒（COVID-19）的病原体，它引发了这个世纪以来影响力最大的公共卫生危机。在写下这句话时，全球已经有超过750万人被感染，超过42万人因感染而死亡，而当你看到这里时，这个数据还在增长着。一个有效的疫苗是人类打赢这场恶战的有力武器，而确定感染所必需的宿主因子，对于了解COVID-19的发病机制、揭示宿主易感性的变化以及确定新的宿主导向疗法（可能对当前和未来的大流行性冠状病毒有效）至关重要。而CRISPR-Cas9技术对于基因组的精准编辑能力让它成为了主要研究手段之一，源井生物也成功利用基于CRISPR-Cas9技术而优化的CRISPR-U™技术对Vero细胞进行了基因编辑，由于CRISPR-U™技术的基因敲除效率高达80%，因此利用CRISPR-U™技术在Vero细胞中进行基因敲除相比于使用普通的CRISPR-Cas9技术具有更高的成功率。

Vero-E6细胞对 SARS-COV-2 感染和病毒诱导的细胞病变效应高度敏感，Wei, Jin等人在Vero-E6中进行了两个独立的全基因组CRISPR筛查，并且使用了两种不同 Cas9 核酸酶构建体（Cas9-v1 和 Cas9-v2）的 Vero-E6 系。他们评估了其中25个基因，包括亲病毒和抗病毒基因，见图1。他们发现亲病毒和抗病毒基因对理解COVID-19的发病机制、治疗方法和疫苗设计具有重要意义，例如SMARCA4可以促进肺泡上皮细胞的增殖，并防止肺纤维化（SARS-CoV和SARS-CoV-2的常见病症）^[4]。

图 1 全基因组 CRISPR 筛选可识别对 SARS-CoV-2 诱导的细胞死亡至关重要的基因

猪流行腹泻病毒(PEDV)是一种阳性单链病毒，属冠状病毒亚科的单链病毒属。氨肽酶N（APN或CD13）是一种Ⅱ型锌金属蛋白酶，可以介导多种细胞生理过程，包括抗原提呈、细胞分化、细胞运动和冠状病毒进入。由于猪APN（pAPN）是猪肠道致病α冠状病毒（TGEV）的主要受体，Ji, Chun-Miao等人通过基因敲除Vero细胞系中 hAPN 或 pAPN 的内源性表达，发现 hAPN 和 pAPN 都不是 PEDV 的功能受体。为了完全排除可能低于检测限的 Vero 细胞中有潜在的 vAPN 产生，他们使用 CRISPR/Cas9 系统生成 vAPN 敲除细胞，即利用两个 gRNA/Cas9 复合物靶向 vAPN-CDS1，删除翻译起始位点下游 290-449核苷酸之间的 160 bp 片段（图2），并通过 IFA确认了这些敲除细胞 Vero-vAPNKO1和 Vero-vAPNKO2缺乏vAPN 的表达（图 3A）。研究结果显示在 PEDV-GFP 感染后，Vero-vAPNKO1和 Vero-vAPNKO2细胞都表现出与正常 Vero 细胞相似的CPE 和 GFP 的表达，这表明 vAPN 敲除对 PEDV 进入和感染没有影响^[5]。

图2 通过 CRISPR/Cas9 在Vero 细胞中敲除vAPN 基因

图3 时间分辨免疫荧光

轮状病毒（RV）是全球范围内引起严重胃肠炎的主要原因，Nichole等人使用siRNAs筛选对RV复制产生负面影响的宿主基因，然后通过CRISPR/Cas9基因编辑敲除选定的基因。与野生型Vero细胞相比，完全测序的基因敲除Vero细胞底物可增加RV复制和RV疫苗抗原表达。结果表明，与其他受试Vero细胞底物相比，EMX2基因缺失的Vero细胞的RV复制和抗原产生更高。基因敲除Vero细胞可以促进增强型RV疫苗底物的开发，并为改进RV疫苗生产提供了帮助。

图4

细菌人工染色体（BACs）是控制DNA病毒（如疱疹病毒）大基因组的有力工具。因为这些DNA病毒（疱疹病毒）的基因组太大，无法克隆到质粒中。例如疱疹病毒 (HSV)，一种常见的 DNA 病毒，基因组长度为 152 kbp，可能会引起唇炎、生殖器疱疹和脑炎。但突变型 HSV 是肿瘤疗法的候选者，可以用于杀死肿瘤细胞。Suenaga等人使用CRISPR/Cas9 系统和Vero细胞作为基质研究突变型HSV，这种方法无需将人工基因插入病毒基因组中，就能实现HSV的基因敲降与基因敲入，还提高了预期突变病毒克隆的分离效率。此外CRISPR/Cas9 系统也可以应用于其他 DNA 病毒，如 Epstein-Barr 病毒、巨细胞病毒、痘苗病毒和杆状病毒，对于研究各种类型的病毒，包括临床分离细胞株具有十分重要的作用^[6]。

图5 使用 CRISPR/Cas9 系统将基因特异性突变引入HSV-1 基因组

参考文献