THP-1基因敲除细胞系 ——免疫与炎症研究的利器

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基因敲除thp-1细胞
THP-1细胞系是从一名患有急性单核细胞白血病的1岁小男孩的外周血中分离得到的[1],自1980年建系以来,THP-1细胞被广泛用于单核细胞和巨噬细胞相关的机制、信号通路以及营养和药物运输等研究中。相对于U937、HL-60、ML-2等白血病细胞系,THP-1更有类似人原代单核细胞的形态和功能特征(包括细胞分化标记)。相对于人外周血单核细胞(PBMC),THP-1更易在实验室中培养和扩增,且具有更稳定的基因背景,不存在PBMC的个体差异性问题,利于实验结果的重现[2]。因此, THP-1是各大实验室常用的急性单核细胞白血病细胞系,是研究免疫和炎症的理想工具。

THP-1 的应用——巨噬细胞分化与炎症模型

THP-1与人原代单核细胞都可以被诱导分化为巨噬细胞M1和M2,并释放相应的细胞因子。
· 巨噬细胞M1极化:
THP-1可被佛波酯(PMA)诱导分化为巨噬细胞,并且可再通过脂多糖(LPS)和IFN-γ诱导M1极化,释放出TNF-α、IL-6等细胞因子,这是典型的炎症模型。
· 巨噬细胞M2极化:
通过 IL-4 、IL-13和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导可实现M2极化,分泌TGF-β、IL-10等抑制性细胞因子,这与炎症后期的组织修复和重建的过程类似。
· 粥样硬化慢性炎症模型:
在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的作用下,巨噬细胞可进一步形成泡沫细胞,这是动脉粥样硬化斑块内出现的特征性病理细胞,是一种慢性炎症模型。

THP-1与CRISPR/Cas9技术相结合,有助于免疫和炎症的疾病研究

THP-1是一种近四倍体的悬浮细胞,常规的基因编辑方法在THP-1中阳性率很低。由于CRISPR/Cas9易于构建、效率较高和在人细胞中的毒性较低,在基因编辑应用中备受青睐。
使用CRISPR/Cas9构建THP-1基因敲除模型,发现与巨噬细胞清除病原体的关键基因
巨噬细胞的吞噬体酸化是其清除病原体的必需步骤,吞噬体酸化与巨噬细胞的代谢以及营养物质转运息息相关,而代谢物的转运与溶质运载蛋白(SLC)密不可分。研究人员发现SLC家族中的碳酸氢盐转运体SLC4A7是巨噬细胞的吞噬体酸化必需的基因。通过CRISPR/Cas9技术在THP-1细胞敲除SLC4A7,吞噬体的酸化能力降低,从而其胞内的杀菌能力也相应降低。进行野生型SLC4A7回补后,则增强了吞噬体酸度。这表明巨噬细胞中SLC4A7介导的、碳酸氢盐驱动的对细胞质pH的维持和对吞噬体酸化至关重要[3]。CRISPR-U™可以通过核转染法高效地将gRNA和Cas9转入THP-1细胞中,药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序验证,筛选出基因敲除的阳性克隆。

使用CRISPR/Cas9与THP-1细胞,构建慢性肉芽肿病(CGD)疾病模型,有助于开发更有效的疾病治疗方法
慢性肉芽肿病(CGD)是一种罕见的X连锁的遗传病,由于机体的CYBB基因发生突变或缺失,导致巨噬细胞缺乏烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸 (NADPH)氧化酶,无法产生过氧化氢来有效杀灭入侵的微生物,这通常会导致细菌和真菌等微生物引起的严重反复感染。有研究者利用CRISPR/Cas9技术,在THP-1细胞中进行CYBB基因的敲除和点突变c.90C>G(该点突变曾在一例CGD患者中被发现),成功构建了首个CGD的细胞模型。对比野生型的THP-1细胞,研究者构建的2个KO克隆(#3和#27)和1个点突变克隆(#2,c.90C>G)在经过PMA和LPS诱导后均出现了H₂O₂水平降低,同时IL-1β、TNF-α和IL-6释放量的明显上升,这与CGD疾病中巨噬细胞的表现一致。
随后,研究者通过慢病毒转染的形式进行CYBB回补,则扭转了这个局面。 这种新的CGD细胞模型为疾病研究提供了强有力的工具,将有助于开发更高效的治疗方法,从而改善患者的生活质量
CRISPR-U™可以通过核转染法高效地将CRISPR/Cas9以及ssODN共转入THP-1细胞中,药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序验证,筛选出点突变的阳性克隆。
通过建立基因敲除和敲入的THP-1细胞模型,明确胞内抗病毒反应的信号通路
DNA通常定位于细胞核中,而异常定位在胞浆中的DNA与通常与病毒感染或肿瘤发生有关。cGAS-cGAMP-STING信号通路可检测胞浆dsDNA的存在,并诱导强效的免疫反应,产生干扰素和激活其他免疫应答基因。与之对应的,RIG1-MAVS可以检测胞浆内的pppRNA(一类dsRNA,某些病毒的基因组),并诱导免疫应答。有时候胞浆内会出现RNA和DNA的杂交复合物,这种分子通常在某些病毒感染的情况下出现。为了研究这种RNA-DNA复合物是通过哪个通路激活免疫应答,研究者分别构建了MAVS、cGAS、STING敲除的THP-1细胞,分别将dsDNA、pppRNA、RNA-DNA复合物导入细胞,发现RNA-DNA复合物是通过cGAS-cGAMP-STING通路进行免疫激活。
随后,研究者通过CRISPR/Cas9技术将2A-GLuc敲入到IFIT1基因座,使其受IFIT1的启动子驱动表达,IFIT1是一个典型的干扰素激活表达的基因。后续实验显示,导入RNA-DNA复合物后,由于干扰素的表达,激活了IFIT1启动子驱动GLuc的表达。这些结果进一步证明了胞浆的RNA-DNA复合物是通过cGAS-cGAMP-STING信号通路激活免疫反应,为抗病毒研究提供了思路[5]。CRISPR-U™可以通过使用通过核转染法高效地将gRNA、Cas9和Donor共转入THP-1细胞中,进行药筛,药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序,筛选出敲入纯合的阳性克隆。
CRISPR-U™可在THP-1细胞中进行高效的基因编辑
CRISPR-U™是源井生物自主研发的应用于基因编辑细胞系的独家技术(基于CRISPR/Cas9技术),通过优化基因编辑载体和基因编辑流程,CRISPR-U™技术的基因切割效率和重组效率是普通的CRISPR/Cas9技术的10倍以上,可轻松实现基因敲除(KO)、点突变(PM)、基因敲入(KI),定制您感兴趣的 基因编辑THP-1细胞系及其他单核细胞系,亦可为您实现各种转基因的需求,助力您的研究。
参考文献:
[1] Tsuchiya S, Yamabe M, Yamaguchi Y, et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP‐1)[J]. International journal of cancer, 1980, 26(2): 171-176.
[2] Chanput W, Mes J J, Wichers H J. THP-1 cell line: an in vitro cell model for immune modulation approach[J]. International immunopharmacology, 2014, 23(1): 37-45.
[3] Sedlyarov V, Eichner R, Girardi E, et al. The bicarbonate transporter SLC4A7 plays a key role in macrophage phagosome acidification[J]. Cell host & microbe, 2018, 23(6): 766-774. e5.
[4] Benyoucef A, Marchitto L, Touzot F. CRISPR gene-engineered CYBBko THP-1 cell lines highlight the crucial role of NADPH-induced reactive oxygen species for regulating inflammasome activation[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2020.
[5] Mankan A K, Schmidt T, Chauhan D, et al. Cytosolic RNA: DNA hybrids activate the cGAS–STING axis[J]. The EMBO journal, 2014, 33(24): 2937-2946.
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