如何快速获得单克隆细胞

如何快速获得单克隆细胞

随着CRISPR/Cas9基因编辑技术越来越普遍，细胞单克隆的形成显得越来越重要。然而，单克隆的成功形成在技术上具有挑战性，单克隆的生长时间长、获得单个阳性克隆的几率极低等问题确实让很多人头疼。单克隆形成率可能会受到多种因素影响，其中两个因素尤为重要，一个是细胞接种存活率，另一个是细胞的增殖活力。

1 如何提高细胞接种存活率

1）保持稳定的pH值

大多数细胞培养基是用CO2碳酸盐缓冲体系配制的，适用于二氧化碳培养箱的二氧化碳分压。但是当这些缓冲剂在正常大气条件下，二氧化碳将从培养基中蒸发，会导致培养基的pH升高到碱性范围（含酚红的培养基中，颜色会变得更紫），这会显著地影响细胞的生存力。因此，在使用细胞培养基时可使用HEPES缓冲体系的培养基，它不依赖于碳酸盐，是一种更好、更安全的选择。

2）保持合适的温度

使用预热至37摄氏度的培养基、胰酶及PBS，使细胞在相对稳定的条件下消化和极限稀释。

3）对于比较敏感的细胞，可相应提高细胞的接种量，例如从96孔板接种50个细胞提高到80个细胞。

2 如何提高细胞的增殖活力

1）适当传代

使用极限稀释法接种细胞后，培养至细胞形成微克隆（∼50‐100个细胞）。将每个孔中的微克隆转移至一个96孔板的新孔中。当新孔中细胞生长至80%的汇合度，将孔中细胞转移至一个48孔板的一孔中。使细胞继续增殖生长至获得足够数量的细胞用于验证分析。

2）添加合适的辅助因子

尽管血清中含有细胞生长所必须的营养物质，在细胞培养基中添加适量的添加剂可以促进细胞生长，例如胰岛素、transferrin和硒。对于某些细胞系，乙醇胺可能也很重要。在某些情况下，附着因子，如纤维连接蛋白、层粘连蛋白、玻璃黏连蛋白和生长因子对细胞的生长也是有益的。

源井生物拥有丰富的基因编辑经验，经过不断的钻研摸索，已形成一套独有的实验方法及流程，可以实现单克隆形成效率比传统方法快3-5倍。结合我们的CRISPR-U™技术，细胞的基因编辑阳性率大大提高！

CRISPR-U™ 是源井生物自主研发的应用于基因编辑细胞系的独家技术（基于CRISPR/Cas9技术），通过优化基因编辑载体和基因编辑流程，CRISPR-U™ 技术的基因切割效率和重组效率是普通的CRISPR/Cas9技术的10倍以上，轻松实现细胞水平的基因敲除（KO）、基因点突变（PM）和基因敲入（KI）。利用CRISPR-U™ 的技术优势，源井生物已成功在超过200种细胞系上实现基因编辑。