circRNA基因敲除细胞株--揭秘其对基因调控的重要作用

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发布日期:2020年08月06日
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circRNA基因敲除细胞株
环状RNA(circular RNAs, circRNAs)是一类由mRNA 前体(pre-mRNA)经反向剪接形成的共价闭合环状非编码RNA。CircRNA最早是在上世纪70年代在病毒中被发现,但是由于早期RNA文库制备广泛使用polyA富集的方式(circRNA没有游离的5’和3’末端),以及RNA-seq读数要求以线性方式与基因组对齐的计算算法,导致大量circRNA的信息被遗漏,使得人们一度认为环状RNA只是错误剪接的副产物,对circRNA的关注并不高。 随着高通量测序技术和生物信息学的发展,成千上万种circRNA被发现,围绕着circRNA的基础研究也越来越多。大量研究表明circRNA在哺乳动物细胞中具有内生、丰富、保守、稳定等特点,并经常表现出组织或时空特异性,可以通过多种机制参与机体生长发育调控,以及疾病的发生和发展。因此,近年来circRNA逐渐成为非编码RNA研究领域的热点。

circRNA 与疾病的关系
目前研究最多的是circRNA与实体瘤之间的关系,促进肿瘤生成的一些circRNA,如头颈部鳞状细胞癌中的circPvt1;结直肠癌、食道鳞状细胞癌和肝细胞癌中的cirs-7(CDr1as)。抑制肿瘤的circRNA,如胶质母细胞瘤中的circsMARCA5 和 circ-SHPRH。还有一些circRNA在不同组织或不同细胞所起的作用可能不同,如circHiPK3,在直肠癌中是原癌基因,但是在膀胱癌中又是抑制癌细胞的。
除了癌症,研究还发现circRNA与糖尿病,心血管疾病,慢性炎症和神经系统疾病都有密切的关系。相信随着生物技术的发展以及越来越多对circRNA的深入研究,circRNA的形成和作用机理可以更加清晰,在疾病预防,诊断及治疗方面也可以起到重要的作用。
circRNA 的基因编辑与调控,为疾病研究与治疗助力!
circRNA涉及许多复杂的功能,那一般是如何对它的功能进行研究的呢?和编码基因类似,常见的做法是将该circRNA敲除(降)或者进行过表达,下面我们介绍下几种最常用的circRNA基因编辑与调控。
CRISPR/Cas9技术敲除特定circRNA,揭秘其对肿瘤形成的调控机制
circRNA敲除是指在基因DNA水平进行编辑,达到彻底敲除的目的。最常用的是在circRNA exon的两端设计2条gRNA,敲除整个环化的外显子序列。这种方案虽然可以敲除circRNA,但是在敲除circRNA的同时,也会影响到编码蛋白的亲本基因,对于其功能的研究并不太理想。
由于对亲本基因影响较大,目前越来越多研究者已经放弃使用这种方案敲除circRNA,比较理想的方法是敲除外显子侧翼内含子中的成环元件,来达到破坏circRNA成环同时又不影响编码基因表达的目的。但是这种circRNA敲除方案比较难设计,许多初入门者很难掌握设计打靶方案的逻辑。
circRNA敲除方案
以circ-HIPK3为例,circ-HIPK3是人体细胞内含量丰富的一种环状RNA,它可以与多种miRNA结合,作为细胞生长的调节剂,影响肿瘤的形成。为了验证circ-HIPK3成环的机制,需要找到侧翼内含子中的成环元件,对上下游预测的两个成环元件分别设计一对sgRNA,利用CRISPR/Cas9系统将预测的成环元件进行敲除,检测circRNA表达情况是否发生变化。经过PCR和RT-QPCR验证,发现下游成环元件敲除后,circHIPK3表达明显下调,而上游成环元件敲除后,circHIPK3的表达不仅没有下调还有所升高。推测可能是上游的成环元件序列太多,预测的不准确。为了进一步验证是其他成环元件驱动的成环,将gRNA3或gRNA4分别与gRNA5或gRNA6共注射,敲除成环元件上游大片段内含子。RT-QPCR结果显示circHIPK3表达确实下降了,说明上游是由其他的成环元件起到成环的作用。
circRNA敲除方案设计
源井生物凭借丰富的基因编辑方案设计经验,对circRNA设计敲除外显子侧翼内含子中的成环元件的方案,来达到破坏circRNA成环同时又不影响编码基因表达的目的。结合CRISPR-U™高效编辑技术,效率是普通方法的10倍,可以快速筛选出circRNA敲除的阳性克隆。
敲降特定circRNA,揭秘其对细胞增殖和凋亡的调控机制
在研究circRNA功能的方法中,最经典的抑制circRNA的方法是通过RNAi的方式(shRNA)进行敲降。为了避免影响到mRNA,设计方案时需将干扰序列设计在反向剪接位点处。 利用siRNA对circ-HIPK3进行干扰,观察circ-HIPK3敲降后,是否会影响细胞增殖或者凋亡 。首先设计三组实验,分别针对HIPK3 mRNA线性转录本、circ-HIPK3环状转录本和两种转录本共有部分设计siRNA,并在HEK-293T细胞系上验证设计的siRNA只干扰相应的转录本。利用增殖凋亡检测试剂盒:CCK-8和EdU进行细胞增殖凋亡检测,结果显示HIPK3 mRNA敲降后不明显影响细胞增殖,而circ-HIPK3敲降后,会明显抑制细胞增殖。 源井生物可通过设计高效的shRNA,用慢病毒法将干扰载体转入细胞中,根据最佳药筛浓度对细胞进行药物筛选,直到对照组细胞全部死亡,获得circRNA敲降的稳定细胞株
过表达特定circRNA,揭秘其成环机制
circRNA过表达一直有成环效率低,容易错配成环等难点。通过优化侧翼成环框架,如成环元件、QKI等RBP的结合位点,使circRNA准确高效环化。过表达后仍需要检测是否成功成环,以及线性mRNA是否表达。为了研究一种新环状RNA载体表达系统的成环效率,选择小鼠circRtn4环状基因在多种细胞系(包括Hela,N2a,HEK293)中进行表达验证。根据不同细胞系中进行的RT-QPCR实验数据显示,新载体系统pCircRNA-DMo-Rtn4成环效率在几种不同的细胞系中均比普通的载体系统(pCircRNA-BE-Rtn4)要高效得多。

CRISPR-U™可在肝细胞系中进行高效的基因编辑

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参考文献:
[1] Kristensen, L. S., Andersen, M. S., Stagsted, L. V., Ebbesen, K. K., Hansen, T. B., & Kjems, J. (2019). The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics, 20(11), 675-691.
[2] Santer, L., Bär, C., & Thum, T. (2019). Circular RNAs, a novel class of functional RNA molecules with therapeutic perspective. Molecular Therapy.
[3] Zheng, Q., Bao, C., Guo, W., Li, S., Chen, J., Chen, B., ... & Liang, L. (2016). Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature communications, 7(1), 1-13.
[4] 刘旭庆,高宇帮,赵良真,蔡宇晨,王汇源,苗苗, 顾连峰,张航晓.环状RNA的产生、研究方法及功能. Hereditas (Beijing) 2019 年6 月, 41(6): 469 ―485

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