KO细胞多基因型是怎么回事？

KO细胞多基因型是怎么回事？

很多老师在构建基因敲除（KO）细胞时，基因型鉴定环节可能会遇到一种情况：单克隆靶标位置的测序峰图是套峰，甚至出现不止2个峰型？这是怎么回事呢，这个克隆还能继续用吗？小源今天就来跟大家唠一唠KO细胞多基因型这件事。

图1 单克隆基因型鉴定，出现套峰

Q1：为什么编辑后会产生不同的基因型？

我们先回顾一下CRISPR Cas9技术的工作原理：CRISPR-Cas9系统通过sgRNA引导Cas9酶到基因组中的特定位置，产生双链断裂（DSB）。由于细胞无法在DNA被切断的情况下存活很长时间，所以一旦DNA断裂，修复断裂的步骤很快就开始了。非同源末端连接(NHEJ)是大多数真核生物修复DSB的主要细胞修复途径^[1]。NHEJ修复的过程中容易出错，可能会随机插入或者缺失一些碱基（indels）。如产生非3倍数长度的indels，会引起基因翻译时的移码突变，破坏蛋白功能，从而实现基因敲除。

NHEJ的修复既然是随机的，那么每个等位基因修复后的情况就可能不同。在基因编辑的实际操作中，sgRNA与Cas9酶结合并作用于基因组的过程并非完全一致，存在一定的随机性，可能导致同一等位基因的DNA断裂位置和修复结果存在差异^[2]。同时，细胞内的其他分子和环境因素也可能干扰修复过程，进一步增加了基因型多样性的可能性。

图2 CRISPR Cas9非同源末端连接(NHEJ)示意图^[3] 

Q2：为什么基因型还有超过2种的情况呢？

哺乳动物正常体细胞是二倍体，但是绝大部分实验用的细胞系是癌细胞，癌细胞在发展过程中可能经历复杂的基因组不稳定性和染色体异常（如染色体重排、复制、缺失或增加等），使其更能适应不同的环境条件，获得生长优势。这些异常导致了非二倍体状态，通常表现为倍体异常（aneuploidy）或多倍体。染色体的异常会导致一些基因的拷贝数发生变化，出现2种以上的等位基因数量。下图是Hela细胞某一种核型，不同编号的染色体数量差异很大，其中5号染色体竟达到8条之多^[4]。

图3 HeLa细胞比正常的细胞有更多的染色体

基因编辑小tips：大家在实验开展前，可以了解一下目标基因在细胞中的拷贝数是多少，这有利于了解KO细胞基因型和获取纯合子的难度。推荐大家使用红棉网站上小工具：基因拷贝数评估系统（网址：https://www.rc-crispr.com/tools/gene_copy_number.html），该工具可以根据基因组测序结果与核型数据，计算出细胞系中不同基因的平均拷贝数。拷贝数越高，获得基因编辑纯合子难度越大，可用于项目综合难度评估。

图4 源井官网基因拷贝数评估工具 

Q3：那如何将不同基因型进行区分呢？

小源给大家介绍三种常用方法：

1.Sanger测序+基因型分析工具

对靶标区域进行PCR扩增，将PCR产物进行Sanger测序。然后，可以使用红棉网站上另一个工具：基因型分析系统（https://www.rc-crispr.com/tools/gas.html）对测序结果进行分析。这种方法方便快捷，只需对PCR产物进行测序即可，在基因型分析工具的帮助下快速区分不同的基因型以及编辑效率，大幅度提高了鉴定效率和降低实验成本。

图5 源井官网基因型分析工具

案例分析：二倍体单克隆细胞的两种基因型（两个等位基因均被编辑，但缺失情况不一致）

图6 源井基因型分析工具结果

2.TA克隆/Topo克隆+Sanger测序

对靶标区域进行PCR扩增，根据PCR产物的状态选择合适的克隆方法，PCR产物一般5'端没有磷酸化，可以直接进行Topo克隆或者加“A”尾后进行TA克隆^[5]。克隆后，筛选克隆子并进行Sanger测序。该方法通过将PCR产物连接到克隆载体上以区分不同基因，但是还需要筛选克隆，步骤较为繁琐。

图7 Topo克隆示意图

分子生物学小知识：

TA克隆：利用某些DNA聚合酶（如Taq聚合酶）在PCR产物的PCR产物的3'末端非模板依赖性地添加腺嘌呤（A），这使得可以将该PCR产物可以与线性化载体的3'末端的胸腺嘧啶（T）通过互补配对进行连接^[6]。

TOPO克隆：TOPO克隆是一种一步式技术，通过单一酶（拓扑异构酶I）的作用将DNA片段插入线性化载体。TOPO克隆适用于平末端或粘性末端的PCR产物，且无需添加额外的“A”尾。

3. NGS测序

NGS测序可以对靶序列中基因组编辑的定量评估，也可用于检查脱靶效应。首先对靶标区域进行PCR扩增，纯化回收PCR产物，建立NGS文库，上机测序^[7]。该方法操作比较简单，可以将PCR产物交给测序公司进行后续步骤，但是成本较高。

图8 单克隆进行NGS测序^[7] 

Q4：多基因型KO细胞能用吗？

基因敲除实验中细胞基因型鉴定结果主要有几类：

1）野生型（Wide Type，WT）：靶基因的所有等位基因均未产生编辑，和野生型细胞系一致，此类细胞可作为实验阴性对照使用。

2）KO杂合子（Heterozygotne，HE）：靶基因部分等位基因为WT，部分为KO移码基因型。此类细胞可以作为敲低细胞使用（类似RNAi的干扰效果），尤其是基因敲除纯合致死的情况下，如果杂合KO有表型，可以直接在文章中使用。

3）KO纯合子（Homozygote，HO）：靶基因全部为KO移码基因型，且基因型完全一致，这种是最理想的基因型，无需多说！

4）复合杂合子（Compound Heterozygote）：靶基因全部为KO移码基因型，但不同等位基因缺失的情况有所不同，比如一个等位基因缺1个bp，另外一个等位基因缺5个bp。这种情况因为每个等位基因都发生了移码突变，都达到了KO的效果，可以等同于第3种基因型，广义上也可以叫“ko纯合子”，属于可正常交付的KO克隆。

好啦，今天就到这里，大家看完后，是不是对KO细胞多基因型这一现象不再陌生啦？如果您有更多基因编辑细胞相关的疑问，可以联系我们小源哦，问的人多就马上安排！还有可能被我们选中送出精美周边哦！

参考资料：

[1]Chang, Howard H Y et al. “Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.” Nature reviews. Molecular cell biology vol. 18,8 (2017): 495-506. doi:10.1038/nrm.2017.48

[2]https://blog.addgene.org/crispr-101-validating-your-genome-edit

[3]https://www.addgene.org/guides/crispr/#design-grna

[4]Smirnov, E et al. “NORs and their transcription competence during the cell cycle.” Folia biologica vol. 52,3 (2006): 59-70.