干货|快速掌握MCF7细胞培养和基因编辑Tips！

干货|快速掌握MCF7细胞培养和基因编辑Tips！

MCF7细胞是从转移性乳腺癌患者的胸腔积液中分离建立的，具有雌激素受体（ER）阳性和孕激素受体（PR）阳性的分子特征。常被用作ER阳性乳腺癌细胞模型。

然而，与其他乳腺癌细胞系相比，MCF7细胞具有生长缓慢，复苏或传代后贴壁缓慢等特性，如果培养不好可能会影响基因编辑或后续实验。今天，小源和大家一起来了解如何培养好MCF7细胞，并掌握其基因编辑的小Tips吧！

图1 细胞生长正常(100×)

以松散的三维团簇的形式出现，前期呈岛状生长，随着时间的推移，细胞会逐步变成扁平单层细胞，通常呈现为多边形或三角形等规则形状。

图2 细胞生长状态差（100×）

细胞形态会发生改变，细胞坍塌不立体，细胞出现老化。

细胞复苏

• 准备：取7mL完全培养基于离心管中备用
• 解冻：将细胞从干冰里取出，用镊子夹住盖子放入 37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化，直至冰块融化至绿豆大小，停止水浴
• 离心：将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，1100rpm条件下离心4分钟，弃去上清液
• 重悬与接种：用完全培养基重悬细胞，接种于合适大小的培养瓶中
• 培养：将培养皿或培养瓶置于37℃培养箱中培养，24小时后观察细胞状态及贴壁情况

细胞传代（以T25瓶为例）

• 当细胞汇合度达到80-90%时可进行传代，传代时在超净台内弃去培养瓶里的培养液，加入5mLPBS洗涤细胞1-2次
• 加入1mL胰酶，轻轻晃动瓶子并使胰酶完全浸过细胞，将培养瓶放入培养箱孵育 1-2分钟，待在显微镜下观察到大部分细胞变圆变亮，轻轻晃动培养瓶两侧有大部分细胞脱落时，立即终止消化
• 加入2倍胰酶体积即2mL完全培养基终止消化，然后转移至15mL离心管中
• 1100 rpm 室温离心 4 分钟，离心结束，弃去上清，加入完全培养基重悬细胞
• 细胞按照1:2-1:3比例传代，传代第二天观察细胞状态

细胞冻存

• 收集细胞：按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中
• 离心：1100rpm条件下离心4分钟，去掉上清
• 重悬与冻存：用细胞冻存液重悬细胞，按每1mL冻存液含1×10^6个细胞/mL分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息
• 降温与储存：将冻存管置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜后转入液氮罐内保存

1. MCF7细胞复苏或者传代后贴壁比较慢，建议48-72小时再观察并进行后续实验
2. 消化时要控制好时间，尽量把细胞消化为单个细胞，但要避免过度消化导致细胞损伤
3. 接种密度不宜过低，建议每次传代比例为1:2-1:3
4. 传代或复苏后可能存在漂浮的活细胞，换液时可离心收集起来继续培养
5. 若细胞一直增殖较慢，可提高血清浓度进行培养
6. 培养时背景中可能有黑点，为细胞代谢产物和细胞碎片，不影响细胞生长。若黑点较多可以在换液时用预热的PBS轻轻润洗

细胞状态差如何调整

1. 培养基和血清：确保使用正确的基础培养基和加入适量血清，血清浓度可根据细胞状态适当调整
2. 细胞培养环境：确认培养温度、湿度、气相条件是否正常
3. 避免使用过期或长时间存放的培养基，新鲜配制的完全培养基建议在两周内使用完毕
4. 细胞传代操作：细胞传代时，注意消化时间和胰酶浓度，避免因消化时间过长或过短导致的细胞损伤

细胞老化如何调整

1. 确认培养条件以及培养环境是否正确
2. 避免胰酶消化过度：合适的胰酶浓度和消化时间，避免用力吹打，造成细胞损伤
3. 增加血清浓度/选择高质量胎牛血清
4. 调整细胞密度：细胞密度过高会导致营养不足和代谢废物积累，从而加速细胞老化，应将细胞密度控制在适宜范围内
5. 添加生长因子，可以促进细胞增殖和分化，有助于改善细胞老化状态
6. 换低代次细胞
7. 通过挑选单克隆等方法，从老化的细胞群体中筛选出具有生长优势的单克隆细胞，进行纯化培养

MCF7细胞转染时注意事项

1. 确保细胞状态良好，细胞处于对数生长期，此时细胞活性高，分裂旺盛，有利于转染效率的提升，细胞密度一般在70-90%之间
2. 注意细胞消化时间，避免过度消化，对细胞造成伤害
3. 实验过程中细胞要吹打成单细胞，避免细胞聚团
4. 细胞进行实验时活率≥80%

电转法

1.实验时控制好电转细胞量，电转后接种到合适的培养板里

2.要保证电转后细胞贴壁率≥70%

3.转染时需控制好实验时间，电转全程不宜过长

慢病毒法

1.实验时要控制好感染前的细胞汇合度30-40%之间，不可过高

2.选用病毒法进行正式实验前可进行预实验找到最合适的MOI;感染前添加助染剂Polybrene

3.对于转染试剂使用前需要充分混匀保证其均匀性

图3 慢病毒感染MCF7(100×)

MCF7铺单克隆实验注意事项

1. 确保铺克隆实验前细胞状态正常，老化细胞少，建议控制细胞汇合度在70%左右
2. 铺克隆时细胞活率≥85%
3. 可先进行预实验找到合适的铺克隆梯度，避免单克隆占比太低
4. 细胞接种96孔板时需确保细胞分布均匀
5. 稀释细胞计数后结果最好落在1*10^6-2*10^6之间

图4 MCF7单克隆(40×)