干货丨MC38细胞培养和基因编辑Tips

细胞培养干货

Expert Insights - Cell Culture

干货丨MC38细胞培养和基因编辑Tips

MC38 小鼠结肠癌细胞株 —— 肿瘤免疫研究的经典“明星模型”！它免疫原性高、成瘤快，是 PD-1/PD-L1 抑制剂验证、癌症疫苗与细胞疗法开发、肿瘤微环境研究以及抗肿瘤药物筛选的理想工具。为科研人员提供高效可靠的实验平台，让肿瘤免疫研究更精准、更快速。今天，小源将带你全方位掌握 MC38 实操技巧：从细胞复苏、传代、冻存，到转染与单克隆铺板，一步步解析关键操作与注意事项，帮你有效规避实验风险，让研究推进更顺畅、结果更可靠！

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细胞名称：小鼠结肠癌细胞(MC38)

细胞形态：上皮样细胞，圆形和贴壁细胞混合，贴壁生长

细胞培养条件：90%DMEM+10%FBS

 气相：空气，95%；二氧化碳，5%

 温度：37℃

换液频次：每2–3 天更换一次培养基

传代比例：1:2-1:4

细胞生长状态参考：

• · 正常状态：MC38 细胞通常呈不规则多角形或梭形，边界清晰，单层贴壁生长不重叠，胞质饱满透亮，生长状态良好（如下图）。

• · 异常状态：细胞形态异常，边缘模糊、胞质不饱满，折光性下降；细胞碎片增多，出现空泡或细胞体积异常增大、形态扁平，提示生长状态不佳（如下图）。

1. 准备培养基

取 7 mL 完全培养基（DMEM 90% + FBS 10%）置于离心管中备用。

2. 细胞解冻

• · 将冻存的细胞从干冰中取出，用镊子夹住管盖放入 37℃ 水浴中快速轻晃。
• · 注意：水面不超过管盖，避免液体进入管内。
• · 解冻约 1 分钟，直至冰块仅剩绿豆大小时停止水浴

3. 离心

• · 将解冻后的细胞悬液转入离心管中，以 1100 rpm 离心 4 分钟。
• · 离心后弃去上清液，小心不要扰动细胞沉淀。

4. 重悬与接种

• · 用完全培养基轻轻重悬细胞，充分混匀。
• · 将细胞接种于合适大小的培养皿或培养瓶中。

5. 培养与观察

• · 将接种好的培养皿或培养瓶置于 37℃、5% CO₂ 培养箱中培养。
• · 24 小时后观察细胞贴壁情况及生长状态，确保细胞复苏正常。

1. 传代条件

• ·当细胞汇合度达到 80–90% 时可进行传代。
• ·在超净工作台内弃去培养液，用 5 mL PBS 洗涤细胞 1–2 次。

2. 胰酶消化

• ·加入 1 mL 胰酶，轻轻晃动培养瓶，使胰酶均匀覆盖细胞。
• ·将培养瓶放入 37℃ 培养箱孵育 1–2 分钟。
• ·显微镜下观察：当大部分细胞呈圆形、折光性增强且能轻易脱落时，立即终止消化。

3. 终止消化

• · 加入 2 倍胰酶体积（2 mL）完全培养基终止消化。
• · 将细胞悬液转入 15 mL 离心管。

4. 离心与重悬

• · 室温 1100 rpm 离心 4 分钟。
• · 弃去上清液，加入完全培养基轻轻重悬细胞。

5. 接种与培养

• · 按照 1:2–1:4 的比例接种至新的培养瓶中。
• · 次日观察细胞生长状态，确保传代正常。

1. 1. 收集细胞：按照细胞传代步骤收集消化好的细胞至离心管中。
2. 2. 离心：室温下 1100 rpm 离心 4 分钟，弃去上清液。
3. 3. 重悬与分装：

• · 用细胞冻存液重悬细胞，调整浓度为 1×10⁶ 细胞/mL。
• · 将细胞悬液分装至冻存管中，并清楚标注 细胞名称、代数、日期 等信息。

4. 4. 降温与储存

• · 将冻存管置于程序降温盒中，在 -80℃ 冰箱中过夜降温。
• · 次日将冻存管转入液氮罐中长期保存。

1. 1. 培养基和血清：确保使用正确的基础培养基和加入适量血清，配好的完全培养基需4℃保存，建议2周内使用完毕。
2. 2. 培养环境：保持培养箱温度、湿度及 CO₂ 浓度稳定，确保细胞处于适宜环境。
3. 3. 操作前准备：传代或复苏前，预热培养基和胰酶至 37℃，避免温度应激对细胞造成损伤。
4. 4. 传代时机：汇合度80-90% 时传代，通常每2-3天传代一次
5. 5. 细胞传代操作要点：注意消化时间和胰酶浓度，避免因消化时间过长或过短导致的细胞损伤；避免过度吹打而造成细胞膜的损伤；贴壁不均匀时可轻摇培养瓶使细胞分布均匀
6. 6. 细胞不贴壁的处理：检查血清质量；使用包被过的培养器皿；改用含EDTA的0.05%胰酶（如TrypLE™），消化时间缩短至30-60秒
7. 7. MC38 细胞生长特性：MC38细胞生长形态为上皮样细胞和圆形细胞混合生长。圆形细胞松散贴壁，需要正常胰酶消化。

1. 细胞状态要求

• · 选用对数生长期细胞（汇合度 70–80%），活率 >95%（可用台盼蓝检测）。
• · 使用低代次细胞，保证转染效率与实验一致性。
• · 注意细胞消化时间，避免过度消化造成损伤。
• · 吹打细胞至单细胞状态，避免细胞聚团。

2. 转染试剂与预实验

• · 转染试剂使用前充分混匀，保证均匀性。
• · 建议进行药物筛选预实验，确定最佳药物浓度，用于转染后药筛。

3. 电转法（Electroporation）

• · 控制细胞量，电转后按细胞数量接种至合适培养板。
• · 使用 PBS 洗涤细胞 1–2 次，彻底去除血清，避免离子干扰。
• · 预实验优化电转参数。
• · 电转后细胞贴壁率需 ≥70%。
• · 控制实验时间，电转全程不宜过长。

4. 慢病毒法（Lentiviral Transduction）

• · 正式实验前进行预实验，找到最合适的 MOI。
• · 感染前细胞汇合度控制在 30–40%，不可过高。
• · 感染前加入助染剂 Polybrene 提高转染效率。
• · 感染 24 小时后换液，去除残余病毒。
• · 避免病毒液反复冻融。

5. 脂质体法（Lipofection）

• · 选择适合 MC38 的脂质体转染试剂，预实验确定最佳转染条件。
• · 转染前 24 小时铺板，细胞汇合度控制在 60–70%。
• · DNA 先稀释于 Opti-MEM，再加入脂质体（禁止反向混合）。
• · 复合物室温静置 15–20 分钟（<10 分钟复合不充分，>30 分钟毒性增加）。
• · 添加复合物时均匀、缓慢滴加至培养基中，轻摇混匀，避免直接冲击或剧烈吹打细胞。

1. 细胞状态

• · 使用对数生长期细胞，铺克隆前细胞汇合度建议控制在 约 70%。
• · 细胞活率需 ≥90%，确保铺板后克隆生长良好。

2. 试剂预处理

• · 所有试剂（培养基、胰酶、PBS 等）提前预温至 37℃。
• · 建议使用温和消化试剂，如 TrypLE Express，减少细胞损伤。

3. 铺板策略

• · 可先进行预实验，找到合适的铺克隆梯度，避免单克隆占比过低。
• · 接种 96 孔板时保证细胞分布均匀；板外围可加入 PBS 防止蒸发。

4. 稀释方法

• · 采用“极限稀释法”进行铺克隆。
• · 细胞稀释计数后，最佳接种量为 1×10⁶–2×10⁶ 个细胞/板。

5. 慢病毒感染（可选）

对于慢病毒转染后的克隆筛选，可参考慢病毒感染图示进行操作，确保感染效率和单克隆形成率。

慢病毒感染后的细胞图片

1. 细胞大量聚集，成团生长

表现：细胞不是单层分布，而是形成大小不一的细胞团

可能原因：

• · 消化不充分：传代时细胞没有被完全吹打成单细胞
• · 培养基过酸：细胞密度过高，代谢产物积累，pH下降，促进细胞聚集

解决方法：

• · 消化后，加入完全培养基，用移液器轻柔吹打多次，确保大部分细胞团被吹散
• · 及时传代，保持细胞密度在50%-80%之间，切勿过度生长（100%融合）

1. 细胞不贴壁或贴壁不良

表现：消化传代后，大量细胞长时间处于悬浮状态，无法贴壁

可能原因：

• · 消化过度：胰酶消化时间过长或浓度过高，损伤了细胞膜表面的粘附蛋白
• · 传代操作过于剧烈：吹打力度过大
• · 血清问题：血清质量差或浓度过低，无法提供足够的贴壁因子

解决方法

• · 消化时间一般在1-2min左右，可每隔1min在显微镜下观察，待观察到细胞变圆后立即终止消化，切勿等到所有细胞都漂浮
• · 吹打时动作极其轻柔，让液体沿壁流下，不要直接冲击细胞层
• · 使用高质量胎牛血清（FBS），浓度保证在10%，新血清需进行测试后使用

2. 细胞状态变差，形态改变

表现：细胞变圆、颗粒增多、透明度降低、碎片增多

可能原因：

• · 培养基问题：pH不正确（CO₂浓度失调）、营养耗尽（未及时换液）
• · 污染：包括细菌、真菌或支原体污染

解决方法：

• · 确保CO₂培养箱浓度稳定在5%，检查培养基颜色，若变黄则立即换液。对于高密度培养，一般2天需要换液一次
• · 在显微镜下仔细观察：细菌污染通常培养基会迅速变浑浊；真菌污染会有丝状物；支原体污染需专用检测。一旦发现微生物污染，立即废弃，并彻底消毒

小提示：MC38 复苏关键在轻柔！水浴解冻、离心去液、均匀铺板，24h观察，小心操作，实验无忧！

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