KO细胞构建技术攻略

KO细胞构建技术攻略

2020年，诺贝尔化学奖授予了CRISPR/Cas9技术的两位先驱者，这一荣誉不仅是对科学突破的认可，更是对基因编辑技术深远影响的肯定。CRISPR/Cas9被誉为“基因剪刀”，能够精准切割DNA，改写生命密码。在基础研究、疾病治疗、农业育种等领域，它已成为不可或缺的工具。

随着技术的不断进步，如何高效构建高质量的敲除（KO）细胞系成为科研人员面临的核心问题。本文将带您全面了解CRISPR/Cas9的技术原理、敲除细胞系的构建方法、实际应用场景及核心挑战，助您高效完成基因功能研究！

1.技术起源：细菌的“免疫系统”

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）最初是细菌抵御病毒入侵的适应性免疫机制。当病毒DNA入侵时，细菌会将其片段整合到自身基因组中，形成“记忆库”。当病毒再次攻击，细菌通过转录生成的crRNA（CRISPR RNA）引导Cas9蛋白精准切割病毒DNA，实现免疫防御。

科学家将这一机制改造为基因编辑工具：通过人工设计的sgRNA（单链向导RNA）引导Cas9蛋白靶向特定基因位点，实现DNA双链断裂（DSB），进而通过细胞自身的修复机制完成基因敲除或插入。

2.技术特点：高效、灵活、低成本

· 精准靶向：仅需设计20bp的sgRNA即可定位目标基因，编辑精准且灵活。

· 广泛应用：适用于人类细胞、动植物、微生物等多种物种。

· 成本低廉：相比ZFN和TALEN技术，CRISPR试剂成本降低90%以上，极大降低科研门槛。

1.sgRNA设计原则

· 优先在ATG之后靠前的外显子选择gRNA，保证敲除效果彻底。

· 针对重叠基因，优先选择目的基因特有区域，避免干扰其他基因。

· 避免设计在重复序列、高GC或低GC区域，减少编辑效率波动。

· 针对目的基因多转录本，选择大部分可靠转录本共有的外显子区域设计gRNA，提高通用性。

· 利用CRISPR等在线工具预测脱靶风险，排除高同源性gRNA，保证编辑特异性。

2.gRNA数量选择

· 单gRNA移码敲除：编辑效率高，适用绝大多数编码基因；缺点是少数短外显子和非编码区敲除效果有限，且鉴定假阳性率较高。

· 双gRNA小片段敲除：两条gRNA切割非3倍数片段，通过PCR长度差异快速判断敲除效果，准确度更高，但设计复杂，递送难度较大。

· 多gRNA大片段敲除或全基因敲除：彻底破坏基因功能，便于验证，但编辑效率较低，鉴定流程较复杂。

源井生物针对细胞系基因编辑自主研发了CRISPR-U™技术，这是基于CRISPR/Cas9技术的一整套优化方案，涵盖以下核心优势：

· 独特gRNA设计算法（红棉 · CRISPR基因编辑系统），结合细胞基因组特性，针对不同细胞系进行精准优化。

· 上千种细胞系编辑参数摸索，形成细胞特异的高效编辑方案。

· 精准检测Cell Pool编辑效率，快速反馈编辑结果，保证后续单克隆筛选准确。

· 单克隆形成率提升方法，提高克隆扩增成功率，降低筛选难度。

· 高通量鉴定微量细胞基因型技术，能在极低细胞量下快速精准鉴别阳性克隆。

相较于传统基因编辑方法，CRISPR-U™技术能将细胞基因编辑效率提升10-20倍，实现快速准确鉴别，提前4周筛选到阳性克隆，大幅缩短项目周期，提高实验成功率。· 点击了解详情>>

1. 基础研究: 敲除关键基因如TP53，有助于揭示肿瘤发生机制，CRISPR文库技术则支持高通量功能基因筛选，加速科研进展。

2. 疾病模型构建: 通过敲除APP基因构建阿尔茨海默病模型，利用患者来源的iPSC敲除致病基因，模拟遗传病，为临床治疗靶点提供依据。

3. 药物开发: 敲除候选基因验证靶点功能，构建耐药细胞系研究耐药机制，推动新药研发。

4. 农业生态: 利用CRISPR技术敲除作物感病基因，提高抗病性，保护生态环境，推动绿色农业发展。

1. 脱靶效应: 使用高保真Cas9变体、优化gRNA设计，结合全基因组测序监测。

2. 转染效率低: 采用慢病毒或电穿孔技术，辅以转染增强剂。

3. 克隆扩增耗时长: 利用高灵敏度单克隆鉴定试剂盒，结合高通量筛选技术，缩短筛选时间。

4. 基因冗余补偿: 设计多重sgRNA同时靶向多基因，确保敲除效果显著。

基因编辑技术持续升级，单碱基编辑器和Prime Editing将实现更精准无断裂基因改造。脂质纳米颗粒和外泌体等新型递送系统将保障体内编辑安全高效。广泛应用于临床治疗、环境治理等领域，推动生命科学不断向前。

构建敲除细胞系既需要扎实技术积累，也需时间与成本投入。如果时间紧迫，源井生物· KO细胞库5000+热门细胞株，现限时底价特惠¥4980起，全场KO细胞大胆冲！研究罕见基因，建议定制服务，源井· 一站式敲除细胞株解决方案，专业团队全程助力。追求自主可控，选择合适载体及CRISPR-U™技术平台，自建实验室基因编辑核心技术。立即行动，抢占基因编辑制高点！· 联系我们>>

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