构建基因敲除细胞株全攻略 | 掌握关键步骤，助力科研高分发表

构建基因敲除细胞株全攻略 | 掌握关键步骤，助力科研高分发表

随着CRISPR/Cas9基因编辑技术的快速发展，科学家们在研究基因功能、验证药物靶点、探究分子机制等方面迎来了前所未有的变革。特别是通过构建 基因敲除（Knockout, KO）细胞株， 可以实现目标基因的永久性失活，成为功能研究中不可或缺的重要工具。

然而，从理论到实践，构建一个高质量的KO细胞株并非易事。每一个实验环节都需要严谨设计、精准操作与丰富的经验支持。本文将为您系统梳理基因敲除细胞株的标准构建流程，并结合源井生物的CRISPR-U™平台，助您高效、高成功率地完成敲除细胞系构建。

· 设计基因敲除方案，构建gRNA表达载体

· 细胞转染

· 初步筛选并扩增KO细胞群体

· 单克隆细胞挑选与扩增

· KO效果验证（基因组、蛋白质与功能水平）

每一步都可能成为决定成败的关键点，因此建议科研人员在尝试自主构建之前，对流程有全面理解，或选择可信赖的服务平台加速研究进展。

基因敲除细胞工作流程

gRNA（引导RNA）负责引导Cas9核酸酶定位到目标DNA区域，是实现基因编辑的关键。

gRNA设计要点包括：

· 靶点选择需位于关键外显子区域

· 避免潜在的脱靶区域

· 结合细胞特异性参数优化gRNA表达

推荐工具：

源井生物自主开发的红棉系统-CRISPR基因编辑设计工具”,支持在线自动生成3套敲除策略，并覆盖超过800种细胞系的参数数据。平台还内置超过10,000个实验验证通过的gRNA载体序列，为您的项目提供高可靠性解决方案。点击了解详情>>

在CRISPR系统导入细胞过程中，转染方法的选择与优化极为关键。每种细胞系（尤其是干细胞、原代细胞和免疫细胞）对转染条件的反应不同 

常见转染方式：

· 电转

· 脂质体转染

· 慢病毒感染（适用于难转染细胞）

源井生物在基因编辑领域深耕多年，已成功优化超过300种细胞系的转染方法，积累了丰富的参数数据库与实操经验，能够显著提高转染效率，缩短实验周期，有效解决不同细胞类型难以转染、编辑效率低的问题。

高质量的敲除细胞株需来源于单细胞克隆。目前常用的方法包括：

极限稀释法：操作简便、低成本，适合多数贴壁细胞

FACS单细胞分选 (fluorescence-activated cell sorting, FACS)：适用于复杂细胞群，可高效分选阳性细胞亚群

在此阶段，细胞生长状态与培养条件非常关键。源井生物在预实验阶段即可评估单克隆形成能力，并采用多策略确保目标克隆顺利扩增。

验证是构建KO细胞株的最后一环，常用检测方法包括：

基因组水平：qPCR、Sanger测序、NGS

蛋白水平：Western blot（WB）、质谱

功能水平：流式细胞术（FACS）、免疫荧光等

其中，WB验证是评估服务质量与文章发表标准的重要指标。源井生物在WB验证方面具有极高成功率，是高分文章客户的常用选择。点击咨询详情>>

成熟体系支持：CRISPR-U™平台已覆盖5000+现货KO细胞株现货充足，广泛用于科研项目和药物研发。

高效率设计：自动化系统1分钟生成3套KO策略，搭配3大风控工具全面评估项目可行性。

全流程优化：涵盖gRNA设计、转染优化、单克隆筛选至多重验证，确保高成功率。

广泛应用验证：多数细胞株均通过qPCR、Sanger测序、WB等多层级验证，结果可靠、可溯源。

一站式服务： 支持定制化细胞株构建与后续功能分析，助力高水平课题推进与论文发表。

构建基因敲除细胞株是分子生物学研究中的一项核心技术，它的成功实施离不开科学的设计、合理的流程管理与丰富的实验经验。若您正在计划启动KO细胞株构建项目，选择源井生物，让基因编辑更简单、更高效、更可控。

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参考文献

Generating Single Cell–Derived Knockout Clones in Mammalian Cells with CRISPR/Cas9. Curr Protoc Mol Biol. 2019.