CRISPR筛选实验中，究竟采用全基因组文库还是亚库？

技术选型关键点 | CRISPR筛选实验中，究竟采用全基因组文库还是亚库？

随着CRISPR/Cas9技术在基因功能筛选中的广泛应用，研究者常面临“文库该选全基因组还是亚库”的关键抉择。本期小源将带大家深入解析全基因组文库与亚库的概念与核心差异，从覆盖范围、筛选成本、实验难度等多个维度进行对比分析，并结合不同实验场景，提供实用的选择指南。希望本文能帮助科研工作者全面理解各类CRISPR文库的优势与局限，为高通量筛选实验的设计与实施提供有价值的参考依据。

CRISPR基因组筛选已成为研究基因功能和复杂表型的重要工具。相比早期的RNAi策略，CRISPR/Cas9介导的sgRNA文库筛选系统具有更高的敏感性，并且几乎可以靶向调节任何DNA序列[1]。在一次筛选中，成千上万个针对不同基因的sgRNA可通过慢病毒同时导入细胞，从而在基因组范围内揭示影响特定表型的基因。然而，文库规模过大也带来成本高、工作量大的问题[1]。因此，“全基因组文库”和“亚库”两种截然不同的策略应运而生。你是否也面临这样的困惑：当研究目标需要考虑全局基因还是聚焦特定通路时，该如何决策？小源首先介绍全基因组文库和亚库的概念和特点，然后对比它们的优缺点，最后结合实验目的、资源投入等因素给出选择建议。

全基因组文库（Genome-wide library）针对某一物种的所有编码基因设计sgRNA，覆盖范围最大。使用全基因组文库可以在未事先假设靶标的情况下，全面筛选出与研究表型相关的新基因。例如，张锋团队构建的人类GeCKO文库靶向18,080个基因，每基因设计3～4条sgRNA，整个文库共含约64,751条不同sgRNA。这类文库通常包含10万以上的sgRNA，需要海量细胞来维持足够覆盖度（通常建议达到300x以上）并进行筛选。全基因组文库的优点是发现潜在新靶点能力强、不易漏检；但缺点也很明显：文库规模庞大、合成和包装成本高、筛选工作量大，需耗费大量时间和资源[2]。举例而言，全基因组文库筛选后往往需要进行深度测序和二次验证，流程复杂且成本可观。因此，只有在研究目标非常广泛、需要无偏筛选时，才倾向使用全基因组文库。

亚文库（Sublibrary）则只针对特定功能基因集或通路设计sgRNA，规模远小于全基因组文库。常见的亚库包括针对激酶、膜蛋白、信号通路或某类疾病相关基因的文库。这类文库的sgRNA数目通常在数千到一万个量级，极大地降低了筛选规模。与全基因组文库相比，亚库最大的优势是实验成本低、筛选难度小：每个sgRNA在细胞群中的覆盖度更高，数据质量更佳[2]。比如，在仅筛选激酶相关基因时，研究者可以使用一个数千条sgRNA的亚库，从而以较少的细胞数实现高覆盖度。这种定制化文库可以针对实验需求灵活设计，大幅减轻下游验证工作。另一方面，亚库的缺点是覆盖范围局限，仅针对预选基因子集，容易遗漏未知或非目标基因，因而无法实现像全基因组筛选那样全面、无偏的基因功能发现。因此，如果研究已有明确的靶点线索或重点关注特定通路，亚库是更实用的选择；但在探索未知生物学问题时，亚库的局限性也不容忽视。

• · 覆盖范围：全基因组文库覆盖物种所有编码基因，适合探索未知领域；亚库只覆盖特定基因集合，范围有限但针对性强。
• · 文库规模：典型的全基因组文库含有超过10万个sgRNA，需要更多时间和金钱来合成和操作；亚库规模较小，可控制在数千到上万条sgRNA。
• · 筛选成本：全基因组筛选需要大量细胞和试剂，并进行复杂的数据分析；亚库筛选的细胞数量和测序深度要求都明显降低，成本更低。
• · 数据质量：由于亚库内每个sgRNA覆盖度更高，其富集和消耗的信号更易检测，提高了筛选的准确性。全基因组文库由于规模大，可能出现部分sgRNA代表性不足或假阴性情况。
• · 适用场景：全基因组文库适用于首次大规模无偏筛选和全新机制探索；亚库适用于已有假说驱动的研究、小规模验证或资源有限时的靶向筛选。

全基因组文库与亚文库

在决定使用哪种文库时，应综合考虑实验目的与资源条件等多种因素：

• · 研究目标：如果希望发现未知的关键基因或首次系统性筛选，倾向选择全基因组文库；若已有明确的生物学通路或候选基因集合，则应优先考虑亚库
• · 成本与时间：全基因组筛选成本高（细胞培养、病毒包装、测序成本）且周期长；亚库费用和时间投入较少，更适合经费有限或需求迅速得出结果的项目。
• · 技术资源：全基因组筛选需要确保拥有足够数量的Cas9稳定表达细胞系、大规模传代条件和测序能力；若实验室资源有限，亚库可减少对仪器设备的依赖。
• · 数据处理：全基因组筛选产生海量数据，后续的生物信息学分析和候选基因验证工作量大；亚库数据相对精简，易于定位信号。
• · 实验灵活性：若研究过程中需多次迭代或多参数优化，亚库更灵活（可快速设计不同基因集合）；全基因组文库在定制上不如亚库灵活。

综上所述，没有绝对的“最佳”文库类型，只有最合适的选择。科研人员应结合自身研究问题的范围、可用的样本规模、预算和对结果发现广度的期望，进行权衡：对于需要广泛覆盖的探索性项目，全基因组文库提供了强大的发现潜力。而对于聚焦特定信号通路或资源受限的实验，亚库往往更为高效。

CRISPR筛选实验中文库的选择是一个涉及覆盖范围、成本、实验规模和发现潜力等多方面的综合决策。通过明确实验目标、评估资源条件并参考已有文库案例，研究者可以有针对性地选择全基因组文库或亚库。期待小源的分享能够为科研人员在CRISPR文库选型上提供思路，让实验既保持学术严谨，又更具效率和针对性。

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参考文献

[1]1.Liu C, Li Z, Zhang Y. [Application Progress of CRISPR/Cas9 System for Gene Editing in Tumor Research]. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 2015 Sep 20;18(9):571-9. Chinese. doi: 10.3779/j.issn.1009-3419.2015.09.08. PMID: 26383982; PMCID: PMC6000117.
[2]Lei T, Xiao B, He Y, Qu J, Sun Z, Li L. [Development and applications of CRISPR/Cas9 library screening technology in cancer research]. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2019 Nov 30;39(11):1381-1386. Chinese. doi: 10.12122/j.issn.1673-4254.2019.11.18. PMID: 31852637; PMCID: PMC6926087.