干货系列|Hep G2细胞基因编辑实战技巧

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发布日期:2024年06月06日
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干货系列|Hep G2细胞基因编辑实战技巧

干货系列|Hep G2细胞基因编辑实战技巧

今天是3期细胞培养干货-Hep G2本期介绍Hep G2细胞培养和基因编辑的实战技巧

HepG2细胞是一种人源肝癌细胞系,来源于一名患有肝细胞癌的15岁白人男性的肝组织。这一细胞系具有广泛的应用价值,可用于肝母细胞瘤和肝细胞癌体外模型的建立、肝脏药物代谢途径研究以及肝炎病毒感染模型的构建等。此外,经过基因编辑改造的Hep G2细胞系也是肝癌发病机制、耐药机制和癌症治疗等领域的重要工具。

然而,要确保Hep G2细胞的稳定性和实验结果的可靠性,掌握良好的细胞培养技巧尤为重要。在让小源带大家一起了解如何培养Hep G2细胞

首先,先了解一下Hep G2的基本信息。

细胞名称

Hep G2(人肝癌细胞)

货号

YC-C001

生长特性

上皮样,贴壁生长;呈片状小岛形态,容易抱团聚集叠加生长

培养条件

DMEM10%FBS1%P/S

培养环境

空气,95%CO25%37℃

换液频次

23/

传代比例

1:2-1:4

生长正常的Hep G2细胞生长正常的Hep G2细胞

1 生长正常Hep G2细胞(左:汇合度高;右:汇合度低)

细胞培养步骤

细胞复苏

1) 准备工作:准备好所要复苏的细胞;预热水浴锅至37℃;预热完全培养基

2) 超净台内吸取7 mL已预热好的完全培养基至15 mL离心管备用

3) 将细胞从干冰里取出,用镊子夹住盖子放入37℃水浴中快速晃动(注意:水不能没过盖子),使其在1分钟左右完全融化

4) 用单道移液器将细胞悬液转至步骤2)提前准备好的15ml离心管中,1100 rpm室温离心 4 分钟

5) 同时准备一个新的T25培养瓶,加入4mL完全培养基

6) 离心结束,弃去上清,加入1mL新鲜完全培养基重悬细胞后加入步骤5)的培养瓶里,放入培养箱

7) 第二天观察细胞状态及贴壁情况

细胞传代(以T25瓶为例)

1) 当细胞汇合度达到80%-90%时可进行传代,传代时在超净台内弃去培养瓶里的培养液,加入5mLPBS洗涤细胞1-2

2) 加入1mL胰酶,轻轻晃动瓶子并使胰酶完全浸过细胞,将培养瓶放入培养箱孵育1-3分钟,待在显微镜下观察到大部分细胞变圆不贴壁,轻轻晃动培养瓶两侧有大部分细胞脱离时,立即终止消化

3) 加入2倍胰酶体积即2mL完全培养基终止消化,然后转移至15mL离心管中

4) 1100 rpm 室温离心 4 分钟,离心结束,弃去上清,加入培养基重悬细胞

5) 细胞按照1:2-1:4比例传代,传代第二天观察细胞状态

注意事项:
1.Hep G2细胞呈块状生长。细胞传代消化一定要完全轻拍培养瓶至细胞团块完全脱落可进行终止消化,消化不完全的话,细胞容易聚集成团

2. 重悬吹打细胞时尽量把细胞吹散,吹成单细胞但要注意吹打力度需适中温柔,不可大力吹打,避免对细胞造成损伤

3. 细胞对培养条件严格,特别是对血清敏感,需要选择高质量胎牛血清进行培养

4. 由于细胞会呈团块生长,复苏后细胞形态可能会与正常细胞形态存在差异,这是正常的,经过几次传代后细胞形态会恢复正常

5. 细胞培养过程中会出现少量空泡这是正常现象

细胞冻存:

1) 按细胞传代的方法,在超净台内把培养瓶里的细胞进行消化至单细胞悬液,所有液体转移到离心管中

2) 用移液管吹打混合均匀,取20 μL进行细胞计数

3) 1100 rpm室温离心4分钟,离心结束弃去上清,用1~2 mL 4℃预冷的冻存液重悬细胞,随后加入冻存液调整至密度为1*10^6个细胞/mL

4) 将细胞悬液按1 mL/管平均分装至提前贴好标签的冻存管中

5) 将冻存管放置于4℃预冷的程序降温盒中,并在冻存结束的15分钟之内将程序降温盒放置超低温冰箱;

6) 过夜后,将冻存细胞转移至液氮罐内保存

FAQs

如何避免细胞复苏存活率低?

1. 复苏时要做到快且稳

2. 复苏后培养条件选择正确,选择正确的培养基、血清、温度、二氧化碳浓度等,避免过度振动培养皿,减少对细胞的机械损伤

3. 复苏时可先接种至小培养皿培养,待小培养皿长满后再进行扩增

4. 冻存前要确保细胞处于良好的生长状态

5. 可在冻存前消化终止离心结束后用PBS洗涤细胞两次后再加冻存液重悬细胞

6. 可适当提高冻存密度

细胞状态差如何调整?

状态差的Hep G2细胞状态差的Hep G2细胞

2  状态差Hep G2细胞

1. 培养基和血清:确保使用正确的基础培养基和加入适量血清;Hep G2细胞可提高血清浓度进行培养

2. 细胞培养环境:确认培养温度、湿度、气相条件是否正常

3. 细胞传代、换液操作:细胞传代时,注意消化时间和胰酶浓度,避免因消化时间过长或过短导致的细胞损伤;一般23进行一次换液,避免长时间不进行换液处理

4. 细胞复苏及冻存确保细胞复苏和冻存操作规范,以减少细胞损伤和死亡

5. 若细胞密度低,可提高细胞密度至70%以上,细胞密度大,细胞分泌的细胞因子多,有利于细胞增殖。

细胞表面存在死细胞如何处理?

1. PBS摇晃清洗两次,然后加入胰酶进行摇晃润洗,待观察到表面的死细胞有要飘起来的迹象时,快速弃掉胰酶

2. 再次加入PBS清洗细胞,然后加入胰酶正常消化

3. 可在消化终止离心结束后加入PBS重悬再洗细胞一次

基因编辑小Tips

Hep G2细胞如何提高转染效率?

1.确保细胞状态良好,细胞处于对数生长期,细胞密度适中

2.注意细胞消化时间,避免过度消化,对细胞造成伤害

3.细胞进行实验时建议活率>80%

4.实验过程中细胞要吹打成单细胞,避免细胞聚团

5.使用不同转染方法,要注意的细节也有所不同,小源列举了常用的电转法和慢病毒法。

电转法

慢病毒法

1.控制好电转细胞量

2.保证电转后细胞贴壁率≥50%

电转Hep G2细胞电转Hep G2细胞

3 电转Hep G2细胞

1.要控制好感染前的细胞汇合度不可过高


慢病毒感染Hep G2细胞 慢病毒感染Hep G2细胞

4病毒感染Hep G2细胞

Hep G2细胞如何提高单克隆形成率?

1.细胞铺克隆时活率需要>80%

2.铺克隆时选择使用优质胎牛血清

3.铺克隆可用PBS清洗1次

Hep G2单克隆Hep G2单克隆 

5 Hep G2单克隆

又是干货满满的一天,希望这些干货分享能让大家对培养和转染Hep G2细胞更加充满信心!源井的Hep G2细胞系经过上百例基因编辑实验优选,现在野生型细胞+专用完全培养基套餐低至980元!我们还可提供基因编辑技术服务,想要轻松获得优质的Hep G2细胞可以联系小源,现有300+热门基因KO细胞低至4980(包含肝癌领域)~


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根据不同细胞特点选择适宜的转染方法(病毒法,化学转染法或电转法)将gRNA序列和Cas9蛋白转入细胞中,并根据不同的转染方法进行不同时长的药筛。药筛完成后进行单克隆筛选,通过靶位点扩增及测序验证筛选出成功敲除的阳性克隆,最终交付纯合子细胞株与相关数据报告。
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