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【文献解读】源井高效敲除慢病毒助力膀胱癌无创诊断
T1DMR、T2DMR DNA甲基化检测法
背景
膀胱癌（Bladder cancer，BLCA）是泌尿生殖系统最常见的癌症之一，也是全球第十大常见癌症，每年约有549，000例新发病例及约200，000例死亡病例。其中75%的病例被诊断为非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC），其余25%的病例为肌肉浸润性膀胱癌（MIBC），而这两种肿瘤的治疗方法是完全不一样的。因此，在确定治疗方案前，对膀胱癌进行准确分类十分重要。膀胱癌的临床治疗方案的选择依赖于肿瘤分期的准确判定，分期不准确会引入不必要的手术治疗、降低治疗后的生存率，也可能永久性降低患者生活质量。而传统的膀胱癌(BLCA)无创诊断方法敏感性低、特异性低，难以检测早期肿瘤、微小肿瘤、肿瘤残留灶及复发肿瘤，也无法准确区分高级别(HG)和低级别(LG)肿瘤、区分肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）和非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC）。
为此，武汉大学中南医院的Wang等人对膀胱癌的整个DNA甲基化（DNAm）的综合表征进行研究。他们发现DNA甲基化是泛癌症特异性标志物的一种，特殊DNA甲基化的检测可用于癌症确诊及亚型精准分类。故对不同肿瘤组织和常规尿液进行全基因组靶向测序，最终发现循环肿瘤DNA甲基化（ctDNAm）的靶向测序可以帮助我们准确区分HG肿瘤和LG肿瘤、区分MIBC和NMIBC，且在复发预测、预后预测方面较基因组突变及荧光原位杂交检测（FISH）更优异，并发表了题为“Non-invasive diagnosis and surveillance of bladder cancer with driver and passenger DNA methylation in a prospective cohort study”的文章。下面就带大家了解具体研究过程。
通过统计学比较不同组织来源的DNAm谱可以得到每个组别的甲基化差异区域（DMR）（见图1 A），研究人员从中选取了T1DMR（癌变前正常细胞甲基化差异区域）及T2DMR（癌变细胞的甲基化差异区域）进行研究。
单个DNA上多个CpG位点发生胞嘧啶甲基化的情况被称之为甲基化单倍型。在癌症肿瘤发生过程中，T1DMR的甲基化单倍型不会发生变化，也不具备致癌能力，而T2DMR的甲基化单倍型会有所变化，且与癌症进程驱动及肿瘤恶化有着密切联系。因此，研究人员将T1DMR称为passenger位点、将T2DMR称为driver位点，并对与膀胱癌有关的17个T1DMR、T2DMR进行了单细胞RNA和ATAC测序。结果表明，LG肿瘤、NMIBC仅与T1DMR的单倍型有关，HG肿瘤及MIBC则与T2DMR单倍型有关（见图1 C）。而对不同肿瘤分类的患者样品单倍型进行统计，发现T2DMR组中的HOXC9、CCN1、MYOM2、SOX2基因甲基化与HG肿瘤发生有着较强关联（见图1 D），HG肿瘤的单倍型多样性较LG高，且HG和LG肿瘤中的T1DMR单倍型并不相同，提示HG肿瘤中存在明显的表观遗传重排现象，HG/MIBC和LG/NMIBC来源于不同细胞。
图 1 膀胱癌差异性甲基化区域分类
上述实验确认了MIBC和NMIBC起源于不同细胞的分化，研究人员对MIBC、NMIBC的细胞（即尿路上皮基底细胞和尿路上皮中层细胞）的SOX2位点相关驱动基因的T2DMR功能进行了验证。
通过ATAC数据库确定SOX2位点附近的调控元件及其染色体可及性，对膀胱癌细胞系T24（来自MIBC供体）、5637（来自MIBC供体）、RT4（来自NMIBC肿瘤）进行CUT&Tag实验，研究转录因子和染色质调控因子与SOX2区域的结合。实验结果表明基底细胞特有的FOXA1与远端调控区（L1或L4）的结合会抑制SOX2和L4的非增强子依赖顺式相互作用，并激活L1增强子的活性，促进L1与SOX2的相互作用（见图2）。
对此，研究人员先使用Cas9慢病毒（由源井生物提供）构建5637-Cas9, RT4-Cas9和T24-Cas9稳转株，然后转导DMR或 SOX2的KO sgRNA慢病毒（由源井生物提供），对上述TM4SF1癌症阳性亚群（TPCS）细胞系的SOX2相关T2DMR区域、SOX2位点进行敲除以研究T2DMR对SOX2表达的调控作用。结果显示，敲除SOX2-T2DMR后，SOX2无法与L1增强子进行相互作用，导致SOX2 RNA表达下降（见图2 C）。而直接敲除SOX2会减弱TPSC细胞系的迁移、侵袭能力（见图 3），对MIBC的侵袭性有重大影响。这些结果都表明T2DMR是膀胱癌SOX2的重要调控元件，其差异性甲基化会驱动癌症从NMIBC向MIBC转变，提示T2DMR甲基化差异或能成为MIBC与NMIBC分类依据。
图 2. 驱动因子T2DMR与癌基因增强子相互作用以调控其功能
图 3 SOX2对MIBC的侵袭性至关重要
源井为该实验提供了Cas9慢病毒现货及gRNA慢病毒载体构建服务，助力5637-Cas9、RT4-Cas9、T24-Cas9稳转株构建，加快该实验中SOX2-KO细胞自建进程！除了Cas9慢病毒现货、慢病毒载体构建服务，源井还提供腺病毒及腺相关病毒包装服务，点击了解更多慢病毒现货及病毒包装服务详情>>
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采用EUCAS法对MIBC、NMIBC组织进行测序，并根据流行率绘制T1DMR、T2DMR DNAm单倍型热图（见图4 A）。热图显示，DMR单倍型的流行率可以将BLCA样品进行清晰的HG/LG分类，且HG组中不仅有致癌基因突变还有抑癌基因突变（TP53、CDKN、SOX），而LG组中仅有致癌基因突变（见图4 A）。构建模型进行预测发现T1DMR和T2DMR的DNA甲基化检测可以准确反映肿瘤生物学潜在病理、临床特征，用于MIBC、NMIBC的精确分类（见图4B）。
图 4 对DMR甲基化检测法的评估
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随后作者对是否可以在尿液中识别癌症相关甲基化特征进行了验证，发现肿瘤载量与尿液中的DNAm信号呈正相关，并开发了一种BLCA无创检测方法——通过对尿液样品中DNAm单倍型进行多重PCR NGS测序以便予肿瘤进行预测评分（UCAS）。作者对该方法与传统BLCA无创检测方法进行了比较，发现这种新方法有着更高的敏感性及特异性，要优于现有的临床检测方法。
不仅如此，作者还通过对比术前术后临床病理结果及UCAS检测结果证实了UCAS对HG/LG、MIBC/NMIBC分类预测的准确性，及UCAS用于术后残留灶检测及复发预测的可行性与准确性。
该研究确定了肿瘤特异性DMR上的DNA甲基化作为膀胱癌无创检测、监测的生物标志物的效用，开创了一种分类更为准确的膀胱癌无创检测方法，有望为膀胱癌临床治疗提供更便捷、更精准的肿瘤分期判断，为膀胱癌治疗预后提供保障！
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参考文献：
Xiao, Yu et al. “Non-invasive diagnosis and surveillance of bladder cancer with driver and passenger DNA methylation in a prospective cohort study.” Clinical and translational medicine vol. 12,8 (2022): e1008. doi:10.1002/ctm2.1008
