报告基因怎么选?原位敲入还是过表达稳转?源井带你玩转Reporter!
报告基因(reporter gene)是指一类所编码蛋白易于检测(如发光、染色、抗性等)的基因,且这些基因产生的性状不存在于原本的受体细胞/组织器官/个体中。常用的报告基因包括荧光蛋白(EGFP、mCherry等)、荧光素酶(Luciferase,如Fluc、Rluc等)、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)等。
其中LacZ可以被X-gal染色变蓝,常用于整体胚胎或组织切片的基因表达研究,较少用于细胞实验。荧光素酶需要加入荧光素底物后才能产生化学发光,荧光蛋白则在特定波长的激发光照射下可以自发荧光,这两类报告基因常用于细胞转染实验、基因表达检测、启动子/增强子研究、活体成像、蛋白质定位和细胞示踪等。今天小源给大家介绍这两类报告基因在细胞水平常见的应用以及选择策略,希望能为大家的实验设计提供一些思路。
构建能表达荧光素酶或荧光蛋白的细胞系,并将其移植至动物体内,通过分子成像技术或闪烁计数器可进行定量、定性及体内跟踪研究,常用于癌症、肿瘤细胞移植研究。翟向明等人[1]通过构建含有荧光素酶和荧光蛋白的慢病毒载体PTYF-CMV-Luc-2A-RFP-PGK,再通过慢病毒三质粒系统进行病毒包装后感染肝癌细胞SMMC7721,以嘌呤霉素(Puro)进行筛选,结合有限稀释法获得稳定转导细胞株,再将Luc-2A-RFP细胞原位注射到裸鼠肝组织,建立原位肝癌动物模型。经活体荧光成像系统成功观察到肝癌细胞在活体动物体内的分布情况,为肝癌的治疗研究奠定了基础(图1,图2)。
图1.体外生物荧光检测 图2.体内生物荧光检测及对应肝脏肿瘤体积检测
魏淑珍等[2]用逆转录病毒转染法将EGFP基因导入人肺癌细胞系NCI-H460中,构建能稳定高表达EGFP的肺癌细胞株并进行裸鼠皮下成瘤,而后采用原位移植法建立小鼠肺癌原位移植模型,并应用小动物活体荧光成像系统观察肿瘤的生长,该模型可以用于肿瘤药物筛选及其他相关研究(图3,图4)。
图3. 稳定表达EGFP的H460细胞单克隆
图4. 裸鼠原为移植瘤活体荧光成像
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APOBEC3B(A3B)是一种DNA编辑酶,在多发性骨髓瘤和各种其他癌症中诱导基因组DNA突变。为了方便研究A3B的功能,Yamazaki等[3]通过CRISPR/Cas9技术在A3B的3'端敲入了3xFlag-IRES-EGFP,构建了3种骨髓瘤细胞(U266、RPMI8226、AMO1 )的A3B报告细胞系。通过靶向A3B基因的shRNA慢病毒进行敲降验证发现:当A3B mRNA下调时,EGFP荧光强度也随之降低,这证实了报告细胞模型的可行性,可用于后续抗癌药物测试(图5)。
图5.EGFP敲入A3B基因打靶图
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相比于传统的Western Blot、ELISA等方法,报告基因可以在活体中更为直观地监测目标基因表达水平或启动子活性。一般采用在启动子序列后插入荧光蛋白/荧光素酶的方式对进行监测。如:Nina Solberg和Stefan Krauss[4]将mTcf3启动子片段克隆到含有Fluc cDNA的pGL3-basic报告载体中,通过对比萤火虫荧光素酶活性与内参海肾荧光素酶的活性研究小鼠胚胎衍生神经干细胞(NSC)中克隆的mTcf3启动子DNA片段的活性,并发现在4.5 kb和3.5 kb启动子片段之间的截断片段中存在抑制启动子活性的调控元件(图6)。
图6. 不同长度mTcf3启动子活性分析-荧光素酶值
目前研究miRNA靶基因的常规思路为:利用基因预测数据库等生物信息学方法预测miRNA的靶基因为研究提供思路,再通过双荧光素酶报告系统进行验证。双荧光素酶报告系统验证这一步需要在载体上将目的基因3’UTR序列连接至荧光素酶3’端上,通过比较miRNA过表达前后发光强度的改变来确定与miRNA作用的靶基因。如:Marcos等人 [5]经表达数组分析将GSK3B假定为miR-548q和miR-1185-1减肥干预的靶基因,并用双荧光素酶报告系统进行验证。他们在萤火虫荧光素酶基因下游克隆了GSK3B特异的3’-UTR结合区,并构建载体与miR-548q、miR-1185-1模拟物共转染进HEK-293T细胞中,验证了GSK3B为miR-1185-1的靶基因(图7)。
图7. GCK3B与miR-548q/miR-1185-1的结合分析
此外,报告基因在蛋白质相互作用、RNA干扰研究、阳性克隆筛选等方面也有应用。在上述案例中,我们发现,报告细胞系从表达基因上分两种,一种荧光素酶报告基因,另一种是荧光蛋白报告基因。从构建方法上也分为两种,一种是过表达稳转,另一种是原位敲入(Knockin,KI),这两种报告基因和构建方法有何差别,如何选择呢?小源给大家整理了以下干货内容:
荧光素酶相较于荧光蛋白具有灵敏度高、背景干扰低、荧光强度高穿透力强、且容易定量的优势,较常用于启动子活性检测、miRNA功能研究,小鼠移植瘤模型构建等。而荧光蛋白的优势主要为观察方便不需要加底物、毒性低、多种颜色荧光可供选择、图像直观漂亮,适用于多基因报告系统,常用做稳转细胞Marker、内源基因示踪标记、蛋白定位标记及活体成像(一般需要把小动物毛发剔除降低背景干扰)。总体的说,在大部分情况下这两种报告基因都可以使用,具体可以结合需求与优缺点进行选择,也有很多研究者采用荧光素酶与荧光蛋白相结合共表达的方式构建多功能报告细胞。而关于构建方法,一般来说内源基因示踪和蛋白定位等需要采用原位KI的方式构建,其他应用采用过表达稳转株即可满足实验需求。
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参考资料
[1] 翟向明, et al."携带荧光素酶基因肝癌细胞株的构建及在肝癌原位移植瘤模型中应用." 生物技术 28.01(2018):71-76. doi:10.16519/j.cnki.1004-311x.2018.01.0013.
[2] 魏淑珍,etal."EGFP标记的人肺癌裸鼠原位移植模型的建立." 中国肺癌杂志 13.07(2010):670-675.
[3] Yamazaki H, Shirakawa K, Matsumoto T, et al. APOBEC3B reporter myeloma cell lines identify DNA damage response pathways leading to APOBEC3B expression[J]. PloS one, 2020, 15(1): e0223463.
[4] Solberg N, Krauss S. Luciferase assay to study the activity of a cloned promoter DNA fragment. Methods Mol Biol. 2013;977:65-78. doi: 10.1007/978-1-62703-284-1_6. PMID: 23436354.
[5] Garcia-Lacarte M, Mansego ML, Zulet MA, Martinez JA, Milagro FI. miR-1185-1 and miR-548q Are Biomarkers of Response to Weight Loss and Regulate the Expression of GSK3B. Cells. 2019 Nov 30;8(12):1548. doi: 10.3390/cells8121548. PMID: 31801236; PMCID: PMC6953011.