看m6A甲基化修饰如何影响胶质母细胞瘤EMT和VM，这个研究套路必学！

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背景

胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GB）作为公认的中枢神经系统最常见的恶性原发肿瘤，因其侵袭性生长方式及恶性程度极深，无法轻易与附近正常脑组织完全分离，往往导致其在短时间内复发。因此，进一步研究胶质母细胞瘤侵袭性生长的分子机制是十分必要且迫切的。近年来，越来越多的研究发现，调控上皮间质转化（EMT）相关蛋白如CDH1、CDH2和MMPs，或者血管生成拟态（vasculogenic mimicry, VM）过程，可以调节胶质母细胞瘤的迁移和侵袭能力，影响肿瘤发展过程。许多研究者认为对胶质母细胞瘤的EMT和VM过程进行更深入的研究可能为新的治疗胶质母细胞瘤提供线索。

N⁶-甲基腺嘌呤(m⁶A)修饰被认为是真核mRNA中最丰富的修饰，在哺乳动物细胞中起重要作用，该过程由三类蛋白灵活动态地调控：“编码器writer”（类甲基转移酶3 (METTL3)、METTL14和Wilms肿瘤1-相关蛋白(WTAP)）、“消码器eraser”（脂肪质量和肥胖相关蛋白(FTO)和AlkB同源蛋白5 (ALKBH5)）和“读码器reader”（YT521-B同源(YTH)结构域包含家族蛋白(YTHDF1/2/3)、YTHDC1/2）。大量证据表明，胶质母细胞瘤中m⁶A水平可影响肿瘤的增殖、放射抗拒和侵袭。然而，目前对RNA m⁶A修饰在胶质母细胞瘤EMT和VM过程中的作用关注较少。

为了研究RNA m⁶A修饰在胶质母细胞瘤EMT和VM过程中的作用，来自中山大学孙逸仙纪念医院神经科的Min Tao等研究人员在American Journal of Cancer Research杂志上发表一篇名为“Decreased RNA m⁶A methylation enhances the process of the epithelial mesenchymal transition and vasculogenic mimicry in glioblastoma”的文章。该文章报道了他们通过构建METTL3敲低和ALKBH5过表达细胞系模型并结合体外的CCK-8、EdU检测、FCM分析、创伤愈合实验、transwell实验、Phalloidin染色等实验评估了RNA m⁶A修饰胶质母细胞瘤中EMT和VM的生物学作用；最后进一步构建了U87-GFP-Luc/U87-ALKBH5-Luc小鼠原位模型探讨ALKBH5在体内对胶质母细胞瘤的影响。结果发现RNA m⁶A甲基化抑制了胶质母细胞瘤中EMT和VM的过程，为寻找GB的潜在治疗靶点提供了新的视角。

源井生物在该研究中提供了用于构建ALKBH5过表达稳转株的慢病毒，以助力科研人员在ALKBH5稳定表达背景的细胞水平上研究m⁶A修饰对胶质母细胞瘤的影响，为其验证过程打下坚实基础。对于构建常用慢病毒法转染的细胞模型，源井不仅拥有成熟的慢病毒第三代包装系统，更是在上千例真实项目中积累出独家细胞转染体系数据库，覆盖超200种细胞，能提供优质的稳转细胞株构建服务，并满足客户挑取单克隆的需求，点击了解技术详情 >> 

ALKBH5可促进GB细胞增殖，影响细胞周期

在本研究中，作者发现，在GB细胞和胶质瘤组织中，m⁶A RNA水平降低。ALKBH5mRNA高表达的患者获得的中位总生存时间(OS)相对较短，而MEETL3相对高表达的患者延长了无病生存期。作者还对ALKBH5在GB中的功能作用进行了深入研究，其中CCK-8实验表明，上调ALKBH5可以增强体外细胞活力(图1A)。同样，EdU检测也表明，与对照组相比，过表达ALKBH5明显提高了细胞的增殖能力(图1B,C)。另外，通过FCM实验，作者测量了细胞凋亡率和细胞周期分布。他们发现与对照组细胞相比，过表达U87-MG ALKBH5的细胞可以加速细胞周期的S期和G2/M期，并伴随6%的减少率(图1F, G)。这表明了在U87-MG细胞中，ALKBH5可能通过影响细胞周期而不是改变细胞凋亡来促进GB增殖。

图1 

RNA m⁶A水平在GB细胞中调控EMT和VM过程

为了研究U87-MG细胞中RNA m⁶A甲基化在EMT过程中的作用，作者通过创伤愈合实验和transwell发现，过表达ALKBH5或敲低METTL3都可以促进U87-MG细胞的迁移和侵袭能力(图2B-E)。Phalloidin染色显示，过表达ALKBH5可以通过一种主要微纤维蛋白F-actin的重排，导致细胞骨架更加分散(图2F)。在过表达ALKBH5或敲低METTL3的U87-MG细胞中，FN1、MMP2和CDH2蛋白表达均上调，而CDH1蛋白表达下调(图2G, 2H)。这些数据表明，RNA m⁶A甲基化可能对胶质母细胞瘤细胞的EMT过程产生重要影响。

图2 

此外，为了评估U87-MG细胞中RNA m⁶A甲基化水平对VM的影响，作者进行了三维培养。过表达ALKBH5增强了U87-MG细胞形成VM的能力(图3A)。同样，在U87-MG细胞中，敲低METTL3也可以上调VM形成的能力(图3B)。

图3

总而言之，RNA m⁶A甲基化水平的降低可促进胶质母细胞瘤的EMT和VM过程。上调ALKBH5或下调METTL3可通过调控CDH1、CDH2、MMP2和FN1的表达增强胶质母细胞瘤的侵袭性。这个研究强调了RNA m⁶A修饰在不同类型癌症中的不同作用，进一步为GB的治疗提供了新的见解。

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