基因敲除细胞系：如何设计gRNA高效KO，以及避免蛋白残留

基因组编辑是一种理想的研究基因功能的方法。它可以精确地识别和定位基因组中的特定序列，然后改变目标序列以达到各种目的。CRISPR/Cas9系统由于其简单的机制已经成为当今世界基因组编辑的代名词。其中基因敲除是目前CRISPR/Cas9最常见的应用。

在CRISPR/Cas9介导的基因敲除实验中，Cas9核酸酶在gRNA的指引下，打靶目的基因，并产生双链DNA断裂（DSB）。由于DSB的不完全修复而产生插入和缺失（indels），引起移码突变，导致终止密码子提前，实现编码基因敲除的目的。在CRISPR/Cas9实验中，gRNA的选择将很大程度上影响项目的成功率。在选择gRNA的时候，有几个因素可以帮助大家选取有效的gRNA以产生成功的敲除：1）预测gRNA效率；2）选择脱靶风险低的gRNA；3）同时使用多个gRNA以提高敲除效率。在编码基因敲除实验中， DNA水平验证KO结果是首要的，此外，蛋白质水平的验证也非常关键。蛋白水平的验证通常是通过Western Blot实现的，但以下这两种现象，有可能导致截短蛋白仍然表达，从而致使WB验证时出现阳性情况。

(1) 基因产生移码突变后，下游ATG密码子有可能启动翻译，从而导致蛋白表达。或者位于移码突变上游的外显子翻译表达，产生N末端截短蛋白。

(2) 细胞跳过被编辑的外显子翻译表达，产生内部序列缺失的蛋白质异构体。

图1: 抗INDEL效应导致CRISPR基因敲除实验失败的细胞机制

CRISPR介导的基因敲除通常是通过Cas9产生dsDNA断裂来实现的：在切割之后，非同源末端连接（NHEJ）的易出错性质会导致在切割位点有一个或多个核苷酸的插入或缺失（indels），从而引起移码突变，终止密码子提前，并产生无义介导的降解(NMD)， 从而完全敲除基因。因此打靶位点常常选择尽量靠近开放阅读框（ORFs）5′端。然而，这个策略往往会忽略ORF内的存在ATG启动另一个ORF并翻译成截短型蛋白的可能。已经有不少文章报道过这种非法翻译（ITL）蛋白，它是与人类疾病相关的遗传因素。因此，基因编辑介导的阅读框外的突变可能会导致非法翻译，从而表达可被抗体识别的截短型蛋白质。

图2: 翻译重新启动的机制

最近，Mu等人报道，利用CRISPR和单个sgRNA，在细胞系中打靶外显子，可以通过以下两种机制产生外显子跳跃：第一种是在突变的前体mRNA剪接过程中发生的；第二种是由于基因缺失导致多个外显子和其余外显子剪接。

已知跳跃多个外显子的机制是：基因缺失后，完整的外显子被剪接。更复杂和令人关注的是，只有一到几个核苷酸的突变才会导致前体mRNA剪接过程中外显子跳跃。除了内含子-外显子边界的剪接位点外，外显子还包含对剪接效率起积极或消极作用的序列。外显子内起正作用的元件，称为外显子剪接增强子（ESEs），与识别增强剪接机制的因子结合。起负作用的元件称为剪接沉默子（ESSs），它被认为是抑制废置剪接位点的使用。因此，我们可以假设indel通过破坏ESE或偶然引入ESS来促进外显子跳跃。这些机制将造成被打靶外显子缺失的截短型ORF的表达，从而干扰WB验证结果及后续功能实验。

图3: 外显子跳跃的机制

对KO实验进行严格的质量控制是十分重要的，以确保构建的基因敲除细胞不包含隐藏的“惊喜”。理想情况下，我们可以事先预测如何打靶一个基因来避免外显子跳过的问题。在设计KO项目之前，可以做以下实验，以帮助制定避免上述蛋白残留的问题的打靶策略。

1. 具有跳跃能力，如果有，则测定蛋白质编码潜能。例如，分别设计引物，识别位于潜在跳跃外显子上下游的外显子，以及目的外显子，通过比较RT-qPCR结果，我们将能够判断是否发生了外显子跳跃，以及它是否会影响基因敲除结果。

2. 翻译形式检测。在抗体特异性很高的前提下，WB结果中如果出现预期的条带，以及在不同分子量（MW）处有其它杂带，这表明这个基因存在蛋白质异构体。根据大小，并结合上述RT-PCR结果，可初步判断编码异构体的ORF。结合质谱分析则可以进一步确认异构体的存在及来源ORF的构成。

在设计gRNA时，除了常规的参数（靶向效率和脱靶效应），应根据数据库、文献、上述qPCR、WB等检测结果来判断靶基因的潜在的多个转录本、ORF、起始密码子位置、外显子大小和是否不对称外显子，来选择要打靶的位点或区域。比如，如果存在截短型ORF及非法翻译，则大靶位点应该保证同时会破坏这些ORF；如果存在外显子跳跃，则应该避开靶向被条约的外显子；如果因为存在多个ORF、外显子跳跃而无法设计有效的移码策略，则应该考虑采用大片段敲除或直接破坏启动子等策略进行敲除。

总之，CRISPR技术的正确使用始终取决于仔细的实验设计、执行和分析。为一个实验选择gRNA需要平衡最大化打靶效率和最小化脱靶效应，同时想获得无蛋白残留的KO细胞，则必须在gRNA设计阶段综合考虑各种因素，确认最优方案。

Reference:

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