非编码RNA的功能研究,你的方法对吗?

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发布日期:2020年08月06日
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非编码RNA的功能研究,你的方法对吗?


人类基因组DNA核苷酸序列中约93%能被转录为RNA,其中仅2%的转录产物被翻译为蛋白质, 余下98%属于非编码RNA(ncRNA)。 随着microRNA的研究进展,揭示了ncRNA在人类基因转录后调节、细胞生长、分化、增殖中起着相当重要的作用。ncRNA的研究热度最高的主要是microRNA、circRNA、lncRNA。近年来,越来越多科研学者投身非编码RNA的研究中,且硕果累累,以下是自2018年以来各种非编码RNA相关的文章发表数目和国自然基金数目:


非编码RNA国自然基金数目文章发表数*
microRNA100039400
circRNA3003700
lncRNA70017600
来自谷歌学术


研究非编码RNA功能的方法有哪些?该如何选择?


对非编码RNA的研究,可以从功能获得性和功能缺失性进行验证。过表达、RNA模拟物、RNA激动剂可以进行功能获得性验证。对于功能缺失性研究,目前常用的方法有RNAi、RNA抑制剂、拮抗剂、反义寡核苷酸(ASO)、启动子敲除、基因敲除等。


1)RNAi沉默非编码RNA的效果较差,甚至无法干扰某些circRNA和lncRNA。因为RNA干扰在转录后水平起作用的,也就是说RNA要被干扰就要定位在胞浆中,但是,lncRNA是选择性分布在核内和胞质中的,circRNA也有部分定位在细胞核中。因此,传统用于mRNA功能缺失研究的siRNA和shRNA工具不适合lncRNA和circRNA功能缺失性研究。此外,RNAi的脱靶效率极高,容易造成对RNA功能的误判。
2)RNA抑制剂、拮抗剂由于活性和稳定性的限制,不易通过细胞膜。此外,这两种方法主要应用于microRNA的研究,均无法应用在circRNA和lncRNA研究中。

3)ASO无法完全阻止RNA转录和在DNA层面干扰表达。此外,使用ASO方法无法获得稳转株。


CRISPR/Cas9介导的基因敲除可以完美避开上述所有弱点!


基因敲除、启动子敲除在DNA层面完全阻止RNA的表达,并且可以获得稳转株,一次操作,永久使用,是研究长非编码RNA功能最有效的方法!

这两种敲除均可以通过CRISPR/Cas9技术实现。而且CRISPR/Cas9的脱靶效应极低,大大减少了由于脱靶效应带来的误判。安全又好使!


CRISPR/Cas9基因敲除


基因敲除常用的方法包含移码突变和片段敲除,在非编码RNA的研究中,片段敲除更有优势。

移码突变造成的基因敲除,常常会出现以下问题:
1) 无法完整敲除所有转录本;
2) 许多非编码RNA的转录本并未被摸清,无法确认移码突变是否能有效敲除基因;
3) 由于移码突变所形成的的副产物是否会影响细胞功能仍然是个未知数。

片段敲除可以完美避开以上所有问题,为非编码RNA的功能研究提供了极大的便利。

片段敲除 

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