必需基因敲除

总是筛不到KO纯合克隆？你可能敲除了必需基因！

引言

基因编辑经验丰富如你，是否遇到过以下诡异的场景：

1）细胞转染效率非常高：满屏都是blingbling的绿色荧光；

2）gRNA切割效率特别好：pool测序后PAM处的套峰肉眼可见；

可是单克隆鉴定结果一出来，要么是野生型（WT），要么是杂合子（KO+WT），要么是有敲除3的倍数基因型，重新来一次还是相同的结果…… 到底是怎么回事呢？

将目的基因从细胞中敲除，并观察由此产生的表型，是生物学研究中确定基因功能的常用策略，如用于研究细胞信号转导、基因表达调控或结构组成等。然而，有些基因对细胞活力至关重要，基因敲除后会导致细胞死亡，因此通过常规方法难以获得ko纯合克隆。这类基因被称为细胞生长的必需基因，引言中描述的现象很可能就是敲除了必需基因导致筛不到纯合子。

根据全基因组筛查结果表明，必需基因约占人类总基因的10%^[1]。如果你不确定基因是否为细胞的必需基因，如何在实验前进行有效甄别，少走弯路呢？最先想到的方法可能是查找文献，看是否有相同细胞和基因敲除的成功案例。但是查文献毕竟费时间和精力，而且经常找不到完全一样的基因和细胞案例。随着CRISPR文库筛选的广泛应用，越来越多的细胞全基因组敲除数据被公开。源井生物汇集了1400+细胞系近3000w的海量敲除数据，只需输入细胞和基因名，即可一键评估项目致死风险（图1.2）并查找成功案例（图3）。点击免费使用>>>

话说回来，如果恰好遇上高风险基因的敲除，只能束手无策吗？当然不是，源井生物根据多年细胞基因编辑经验，为你整理了3大解决方案。

1）退而求其次。如果基因彻底敲除后会导致细胞死亡，可以通过RNAi降低基因的表达观察是否有表型变化。如果基因敲低有表型，发文一般没问题。

  RNAi文献案例：通过RNAi方法下调 MTA1的表达，可以导致ER α在ER阴性乳腺癌细胞系 MDA-MB-231中重新表达，并降低 MMP-9 和 CyclinD1 的蛋白水平，以及减少肿瘤细胞侵袭和增殖,更多的细胞被阻断在G0/G1期(P < 0.05)。MTA1的沉默作用可有效抑制MDA-MB-231细胞的侵袭和增殖。针对MTA1的shRNA干扰可能在人类乳腺癌中具有潜在的治疗效用^[2]。

2）迎难而上，挑战概率。如果干扰效果确实不好，而基因也只是有一定致死概率的，可以尝试多筛一些克隆看能否幸运获得纯合子。如果没有获得纯合子，KO杂合子或者ko-pool也可以检测一下表达情况，有时候KO杂合子也有表型，可用于发文。

KO杂合子文献案例：NAT10 是一种核仁蛋白，包含一个乙酰转移酶结构域和一个tRNA结合结构域，具有组蛋白乙酰化活性，参与人端粒酶逆转录酶的调控。该基因在绝大部分肿瘤细胞中是必需基因，完全敲除后会导致细胞出现死亡。作者使用CRISPR技术在Lovo细胞中获得NAT10+/-的敲除杂合，进行免疫荧光、Western blotting和测序验证。与对照细胞 (LoVo) 相比，NAT10+/−细胞显示MN形成减少，即NAT10表达下调可以抑制结直肠癌进展^[3]。

图4. NAT10 的表达下调减少了 MN 的形成

这里补充一点，有些敲除致死的基因，可以通过加入特殊添加剂，人为补充细胞生长所需养分，使细胞正常生长增殖，等到细胞扩增至足够量之后，再撤销添加剂，进行功能验证实验。比如白血病细胞系中敲除DHODH基因后，需要在培养基中添加～100µM的尿苷维持细胞生长^[4]。

3）调整方案，条件性敲除。如通过使用tet-off系统和CRISPR/Cas9结合的方法，先用tet-off系统外源表达目的基因，再将内源基因敲除，筛选到KO纯合克隆扩增后，通过加Dox诱导外源基因表达关闭，实现基因诱导敲除^[5]。或通过使用生长素诱导降解系统（Auxin-inducible degron，AID），将AID敲入形成融合蛋白替代内源基因表达，通过添加生长素进行蛋白诱导降解，实现基因功能敲除^[6]。此外，也有将CRISPR/Cas9和cre/loxp系统结合，进行条件性敲除的策略。

图5.条件性敲除策略1

图6.条件性敲除策略2

以上3种解决方案，各有优缺点，第1种RNAi替代法操作最简单，成本较低，成功率高，但有可能出现干扰效果不好，敲除不彻底的问题。第2种加大范围筛选法，只适合部分致死率较低的基因，不确定性较高，时间和费用成本也比较高。第3种条件性敲除策略费用最高，tet-off系统也可能存在部分背景表达的情况，KI的方法则难度较高。总的来说，可以结合时间、经费和具体基因进行方案选择。

源井生物基因敲除现货库扩至3500+KO细胞，涵盖26条信号通路1200+基因，27种疾病类型1500+基因及5大类药物靶点800+基因，低至¥8000，1周达。更有4周极速定制，全方位方案评估和红棉基因风险分析，实验少走弯路，项目更有保障!

[1]Wang T, Birsoy K, Hughes N W, et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome[J]. Science, 2015, 350(6264): 1096-1101.

[2] Jiang Q, Zhang H, Zhang P. ShRNA-mediated gene silencing of MTA1 influenced on protein expression of ER alpha, MMP-9, CyclinD1 and invasiveness, proliferation in breast cancer cell lines MDA-MB-231 and MCF-7 in vitro[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2011, 30(1): 1-11.

[3] Cao Y, Yao M, Wu Y, et al. N-acetyltransferase 10 promotes micronuclei formation to activate the senescence-associated secretory phenotype machinery in colorectal cancer cells[J]. Translational Oncology, 2020, 13(8): 100783.

[4] Sykes D B. The emergence of dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) as a therapeutic target in acute myeloid leukemia[J]. Expert opinion on therapeutic targets, 2018, 22(11): 893-898.

[5] Liao J, Karnik R, Gu H, et al. Targeted disruption of DNMT1, DNMT3A and DNMT3B in human embryonic stem cells[J]. Nature genetics, 2015, 47(5): 469-478.

[6] Nishimura K, Fukagawa T. An efficient method to generate conditional knockout cell lines for essential genes by combination of auxin-inducible degron tag and CRISPR/Cas9[J]. Chromosome Research, 2017, 25: 253-260.