基因敲除细胞的应用

破译海量的遗传信息是一个巨大的挑战。如今，确定基因的作用、了解基本生物学、把基因突变与疾病发病机制联系起来，CRISPR/Cas9使这些复杂的研究变得简单。基因敲除（KO）细胞系是CRISPR/Cas9介导基因编辑中最典型的应用。以下是KO细胞系的潜在应用：

1、 抗体特异性验证

2、 确定参与通路的基因

3、确定药物靶点

4、建立疾病模型

5、开发治疗工具

1.抗体特异性验证

科研圈认为，一个优秀的科研工具对研究的质量有着重大影响。抗体是生命科学研究中最常用的试剂之一，尽管其用途广泛，但目前并没有标准的检验方法对抗体进行特异性验证。例如，未被验证的抗体有可能会产生非特异性结果，导致结果无法复制。有人呼吁使用KO细胞系验证抗体特异性，并应将其制定为抗体的行业标准。野生型和KO细胞系的平行验证，是控制科研试剂的质量的有效工具。

2. 确定参与通路的基因

一条信号通路中，通常存在多个相关但不同的分子和过程。基因编辑的细胞系可以来验证特定基因或突变的作用。例如，JAK1对于某些细胞因子的信号传导是必需的，并且被认为在肿瘤转移中起关键作用。它也被认为与INFγ受体有功能及物理上的联系。当配体与受体结合时，与受体相关的JAK被激活，导致特异性STATs（信号转导子和转录激活子）在细胞质中募集，然后这些STATs就成为了JAK的底物。活化的STATs从受体中释放出来，转移到细胞核中与特定的增强子元件结合，从而影响目标基因的表达。通过敲除JAK1基因可以验证JAK1在STAT磷酸化中的作用，在KO细胞系中STAT没有被磷酸化，这可以通过westernblot来验证。

3. 确定药物靶点

研究通路中各个基因的作用通常会用药理学干预的方法。例如，化疗6-硫鸟嘌呤（6-TG）用于检测DNA损伤反应（DDR）的影响。为了保持基因组完整性，细胞有许多机制，每种机制都是针对不同类型的损伤而特定的。这些DDR通路的效率对细胞毒素治疗的有效性起着至关重要的作用。6-TG是一种生长抑制性抗代谢物质，需要一个活性DNA错配修复（MMR）系统才能起作用。一项研究表明，HPRT+细胞对6-硫鸟嘌呤（6-TG）敏感，HPRT可转化为核苷酸形式，并通过DNA聚合酶将其整合到DNA中，通过复制后错配修复过程杀死细胞。这个策略是通过用两种质粒转染细胞，分别表达HPRT的gRNA和一个相关基因的gRNA。Cas9可以装载在质粒上（例如携带HPRT gRNA的质粒）或整合到染色体上（例如Cas9稳转细胞株）。如果一个细胞对6-TG产生抗性，只要gRNA有效，就可以在这个细胞中打靶感兴趣的基因。因此，如果靶基因在6-TG耐药细胞中没有改变，这就表明gRNA无效。另一方面，如果通过联合打靶却获得不到6-TG耐药细胞，则表明目的基因可能是必需的。因此，KO细胞系可以用来确定6-TG的靶点。

4.建立疾病模型

在患者中确定感兴趣的突变后，下一步是探索导致疾病表型或治疗效果的生物学机制。例如在患者群体中观察到的点突变，通过在KO细胞中回补正常的基因，可以起到修复基因突变以恢复表型的作用。其中一个疾病模型的例子是MAGEC2敲除黑色素瘤细胞系。MAGEC2是Ⅰ型黑色素瘤相关抗原家族的一员，在多种癌症类型中表达，但在正常体细胞中不表达。研究人员利用CRISPR/Cas9技术，在A375黑色素瘤细胞系中敲除MAGEC2基因。他们发现MAGEC2基因的敲除使黑色素瘤细胞对肿瘤坏死因子-α诱导的凋亡敏感。这些研究揭示了MAGEC2促进肿瘤发展。

早期的研究报道指出核因子红细胞2相关因子（NRF2）是100-200个基因的主要调节因子，参与细胞对氧化和/或亲电应激反应。NRF2还可以调节参与蛋白质降解和解毒的基因的表达，并且被杯状ECH相关蛋白1（KEAP1）负调控，KEAP1是依赖Cul3的E3泛素连接酶复合物的底物适配物。一个研究小组使用CRISPR/Cas9系统，通过破坏NRF2核输出信号（NES）结构域来抑制肺癌细胞中的NRF2基因表达；表型上，这种蛋白质在翻译后基本上被阻断了向细胞核的传递。研究发现，这个NRF2基因敲除细胞增殖能力降低，对顺铂和卡铂等化疗药物更为敏感。他们还发现，即使没有药物治疗，纯合基因敲除细胞的增殖速度也比野生型细胞慢。

5. 开发治疗工具

在过去的几年中，以中国和美国为代表的团队进行了一系列基因编辑的临床试验，例如产生更有效的治疗癌症的CAR-T细胞，敲除BCL11A的红系特异性增强子从而上调自体红系HSC中的γ球蛋白，可作为镰刀状细胞病和β-地中海贫血的潜在治疗方法。到目前为止，已经有一些正在进行临床试验的案例，利用敲除自体T细胞的PD-1基因的方法来治疗癌症，包括前列腺癌（NCT02867345）、食管癌（NCT03081715）和肾细胞癌（NCT02867332）。这些试验被认为是将体外CRISPR/Cas9基因敲除技术应用于癌症治疗的概念验证研究。

总之，KO细胞系是一个多功能的工具，有助于我们了解基本生物学，以及确定突变在疾病发病机制中的作用。进一步地，促进了疾病治疗和病人的预后。

Reference::

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