【前沿研究】基因编辑沙门氏菌——靶向性治疗肿瘤的理想载体

沙门氏菌是一种兼性厌氧革兰氏阴性棒状细菌。沙门氏菌属肠杆菌科，是人类和动物的一种重要的医学病原体。在我国，由沙门氏菌引起的食物中毒占细菌性食品中毒事件的40%。沙门氏菌形成了一个复杂的细菌群，包括两个种和六个亚种，包括超过2579个血清型。目前在沙门氏菌属中确认有两个种，S.enterica 和 S. bongori。沙门氏菌选择性地靶向肿瘤组织的特性也使其成为肿瘤靶向性治疗的理想载体。沙门氏菌作为一个胞内寄生菌, 具有在肿瘤组织内高效地复制和有效抑制肿瘤生长的特性。它在基因工程改造后可以作为肿瘤基因治疗的载体在肝癌、胃癌、大肠癌等的体内外应用。

沙门氏菌与肿瘤治疗

1. 减毒沙门氏菌直接抗肿瘤治疗:

针对沙门氏菌可以有效抑制肿瘤生长的特性，科学家利用多种基因工程技术对沙门氏菌的染色体基因组进行改造, 可以实现沙门氏菌的毒力减弱，从而得到减毒的菌株, 在降低对宿主致病力的同时, 依旧让其保有高度的免疫原性, 从而确保了临床应用的安全性。

研究表明, 减毒沙门氏菌有较好的靶向定植性, 对肿瘤有直接的溶瘤作用。利用减毒沙门氏菌定向选择性地在肿瘤组织内复制、增殖, 可有效抑制多重肿瘤细胞的生长, 延长动物存活时间。

2. 作为肿瘤基因治疗载体:

减毒沙门氏菌可携带外源基因、细胞因子、外源效应蛋白等治疗肿瘤。细胞因子可通过直接杀伤肿瘤细胞而起到抗肿瘤作用。外源效应蛋白能经过减毒沙门氏菌有效地传递并且表达出治疗性蛋白。

沙门氏菌敲除phoP基因，构建减毒沙门氏菌，提高沙门氏菌治疗肿瘤的安全性

科学家使用基因剪接PCR方法联合λ-Red系统去删除野生型鼠伤寒沙门氏菌的phoP基因。这种phoP基因是一个转录调节因子，也是在生物适应内环境和巨噬细胞内存活中起关键作用的两个组分调节系统的组成。它还控制了鼠伤寒沙门氏菌致病所需的40多个基因的表达，以及对宿主体内的不良环境如胃的低pH值、胆盐、小肠的低氧和上皮细胞上的阳离子抗菌肽的抵抗能力。鼠伤寒沙门氏菌phoP基因的破坏，导致其无法在噬菌细胞内存活，并增加了其对宿主压力因素的敏感性，从而达到减毒的作用，以便开发更安全的细菌治疗方法。

研究者采用SOEing PCR法和western blot方法对鼠伤寒沙门氏菌的野生型和标准株进行了phoP基因的破坏。采用3个标准PCR和1个融合PCR反应构建包含phoP基因上下游和卡那霉素盒的线性DNA。使用了携带卡那霉素基因的pKD4作为模板质粒，其侧边为FRT (FLP识别靶标)位点。将得到的结构电穿孔成鼠伤寒的感受态细胞。PCR验证后确认，卡那霉素基因已经取代了PhoP基因。因此，通过敲除Phop基因成功构建减毒沙门氏菌。

基因编辑细菌，给科学研究、临床医疗、农业工业生产带来无限可能！

基因敲除已被应用于许多目的，如研究基因功能、疫苗生产和提高对蛋白质的结构或表达的研究。目前，运用较广的传统基因编辑方法包括使用R6K自杀质粒、λ-Red系统。

尽管λ-Red系统看似简单且已经被成功应用于大肠杆菌和其他革兰氏阴性菌，但是由于菌的内在本质差异，这个系统在不同的菌中的表现不一样。此外，自杀质粒载体存在宿主范围狭窄、抗性残留等缺点。传统的基因敲除技术存在后期筛选工作量大（周期），重组效率低，残留loxP或FRT位点等缺点。

CRISPR/Cas9技术是近年来发展最迅速的基因编辑技术，但是由于细菌内缺乏修复系统，使用此技术编辑基因的微生物种类不多。源井生物另辟蹊径，独创了CRISPR-B™技术，CRISPR-B™技术作为一种高效的基因组编辑技术，具有操作简单、靶向性强、脱靶率低、无痕等诸多优势。可对各种细菌进行高效基因编辑，效率超传统方法20倍以上，可快速实现细菌的敲除，点突变或敲入。

沙门氏菌靶向CTNNB1基因的shRNA表达，建立抑制肿瘤的新工具

细菌治疗在临床上治疗腹泻、肠易激综合征、炎症性肠病等胃肠疾病有良好的安全性。对于可以在实体肿瘤内浸润和复制的各种非致病性厌氧菌，可用于研发针对人体实体瘤的疗法。核糖核酸干扰（RNAi）已被确立为一种重要的研究工具，具有巨大的基因治疗潜力。科学家将细菌治疗和RNAi治疗相结合，开发了细菌介导的RNAi，将表达shRNA的载体递送到靶细胞中，从而沉默致病基因。

与对照细胞相比，SW480细胞中CTNNB1基因沉默可显著降低细胞增殖和死亡。

同时，通过构建SW480移植肿瘤模型，验证在体内沙门氏菌介导的CTNNB1基因沉默对肿瘤发育的抑制。BALB/c雌性小鼠被随机分为三组，分别接受磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、SL-Psls-TAT和SL-pSLS-huCAT接种。然后记录两周内各组肿瘤的生长情况以及每个肿瘤中CTNNB1及其下游靶基因c-Myc和cyclin D1的表达。在SW480移植肿瘤模型中，与PBS对照组相比，SL-pSLS-huCAT处理的移植瘤生长降低了65%，与SL-pSLS-TAT处理的移植瘤生长降低了45%。同时，在这些肿瘤中检测出CTNNB1、c-Myc和cyclin D1水平均降低。因此， SL-pSLS-CAT介导的CTNNB1敲低显著降低了SW480移植瘤小鼠的肿瘤生长 。随后，通过APCmin小鼠口服SL-pSLS-mCAT，检测表达CTNNB1 shRNA 的沙门氏菌能否抑制息肉的生长。发现SL-pSLS-mCAT降低了小肠CTNNB1 mRNA水平34%、息肉73%和粘膜组织83%,相比于SL-pLSLS-TAT注射组。 SL-pSLS-CAT治疗也导致这些基因在小鼠息肉、粘膜组织和小肠中表达水平降低。

这些数据表明， 表达shRNA的减毒沙门氏菌可能是体外基因沉默、功能基因组学和基于RNAi抗癌或人体免疫缺陷病毒疗法的发展的一个强大的新工具。

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