源井E.coli基因敲除模型证实膳食D-木糖通过激活噬菌体促进肠道健康

源井E.coli基因敲除模型证实膳食D-木糖通过激活噬菌体促进肠道健康

消灭肠道致病微生物对生物的健康至关重要。然而，肠道群落十分复杂，使得靶向特定的细菌有机体更具有挑战性。越来越多的证据表明，部分食物可以通过调节噬菌体改变肠道细菌的丰度。

中国农业大学动物科技学院韩丹丹^[1]教授课题组在Nature子刊npj Biofilms and Microbiomes上发表题为Dietary D-xylose promotes intestinal health by inducing phage production in Escherichia coli一文，以致病性大肠杆菌ATCC 25922为模型，靶向敲除recA、ldhA基因（由源井构建），发现膳食D-木糖可以通过激活原噬菌体有效降低肠道中大肠杆菌ATCC 25922的存活率，为缓解动物腹泻，开发抗生素代替品提供新思路。

首先在大肠杆菌ATCC 25922中鉴定出3种不同的原噬菌体，使用透射电镜，检查了上清中的噬菌体颗粒。发现大肠杆菌ATCC 25922在含有D-木糖的LB培养基中产生噬菌体，接下来进一步评估了D-木糖对大肠杆菌ATCC 25922噬菌体产生的影响，发现添加D-木糖可降低细胞密度(P < 0.05)(图1)，而随着D-木糖浓度的增加，噬菌体产量和噬菌体：大肠杆菌DNA比率也在逐渐增加，表明D-木糖可以在体外激活大肠杆菌ATCC 25922的噬菌体。在大肠杆菌感染的小鼠模型中添加D-木糖，发现会显著降低了粪便中大肠杆菌ATCC 25922数量，这些结果表明，D-木糖促进大肠杆菌ATCC 25922噬菌体的产生，并抑制大肠杆菌ATCC 25922在肠道中的存活。

图1 D-木糖促进大肠杆菌ATCC 25922中噬菌体的诱导

接下来分析了培养基中的代谢终产物，经D-木糖处理，显著提高了D-乳酸、甲酸和琥珀酸的产量，其中D-乳酸是最丰富的终产物(图2)。此外，随着D-木糖浓度的增加，D-乳酸的产量也逐渐增加，并且噬菌体：大肠杆菌DNA比值与D-乳酸水平呈显著正相关，说明D-乳酸可能参与了噬菌体诱导的调节。

使用源井构建的D -乳酸脱氢酶基因敲除大肠杆菌（ΔldhA突变体），发现ldhA的缺失，抑制了D-乳酸的产生，且降低了噬菌体含量，随着LB培养基中D-乳酸添加量的增加，细胞密度逐渐降低，说明大肠杆菌ATCC 25922中D-木糖介导的的噬菌体诱导部分依赖于D-乳酸。然而，饮食中的D-木糖降低了大肠杆菌ATCC 25922感染小鼠粪便中的乳酸水平，增加了丙酸含量。因此，D-木糖在体外和体内驱动乳酸和丙酸的不同代谢特征。

图2 D-乳酸与噬菌体诱导相关

乳酸是丙酸合成的底物之一，作者研究了可能转化为丙酸的乳酸来源，并进一步探讨了前噬菌体诱导与肠道丙酸水平的关系。先用草酸盐处理小鼠，通过抑制L-乳酸脱氢酶来阻断L-乳酸的产生，然后用大肠杆菌ATCC 25922感染(图3)，发现草酸盐在很大程度上减弱了大肠杆菌诱导的L-乳酸合成，但对D-乳酸没有影响。接着，作者在体外测试了草酸对大肠杆菌D-乳酸生成的影响，随后给小鼠补充D-木糖，再用草酸盐和大肠杆菌处理，结果表明其对D-乳酸浓度、粪便丙酸和噬菌体：大肠杆菌没有影响，说明宿主来源的L-乳酸不是合成丙酸或诱导噬菌体的底物。之后作者使用ATCC 25922的野生型、 ldhA缺陷型和ldhA过度表达突变株对小鼠进行感染，发现添加了D-木糖的ldhA+突变小鼠的粪便丙酸水平最高，但ΔldhA小鼠的粪便丙酸水平显著降低，噬菌体的产量也以与丙酸几乎相同的趋势发生变化。这些结果表明，大肠杆菌ATCC 25922代谢D-木糖，产生D-乳酸，D-乳酸又被肠道菌群利用产生丙酸。后续作者证实肠道内将D-乳酸转化为丙酸的为梭菌。

图3 大肠杆菌ATCC 25922代谢的D-乳酸是丙酸合成所需的底物

之后，作者通过在大肠杆菌LB培养基中添加丙酸或丙酸钠，以及大肠杆菌感染的小鼠饮用水中添加膳食丙酸钠，都发现了丙酸可以促进大肠杆菌ATCC 25922中的原噬菌体诱导。

许多噬菌体得益于SOS应答的沉默而保持稳定状态，SOS系统的激活通常与噬菌体的产生有关，在大肠杆菌中，SOS系统的关键调控蛋白是RecA。为了确定大肠杆菌ATCC 25922中的噬菌体诱导是否依赖于RecA，作者使用源井协助构建的ΔrecA敲除株，发现敲除株的噬菌体产量显著降低，且在以D-木糖为唯一碳源的MOPS培养基或添加丙酸钠的LB培养基中长得更好(图4)。这表明大肠杆菌ATCC 25922中的原噬菌体诱导依赖于RecA。使用野生型和ΔrecA敲除株给小鼠灌胃，在ΔrecA敲除株组别中作者观察到了更严重的炎症，粪便中大肠杆菌ATCC 25922水平较高，噬菌体水平较低。总之，这些数据表明，膳食D-木糖或暴露于丙酸通过诱导SOS反应触发噬菌体产生。

图4 抑制大肠杆菌ATCC 25922噬菌体诱导可使肠道炎症反应恶化

鲜有研究报道膳食D-木糖对肠道微生物组成和噬菌体改变的影响，作者为此提供了强有力的实验证明，膳食D-木糖通过促进噬菌体产生来降低大肠杆菌ATCC 25922的存活率，从而促进肠道健康，并阐述了相关机制，揭示了通过调节温带噬菌体改善动物和人类肠道健康的分子框架，同时为开发膳食噬菌体诱导剂作为作为治疗病原体感染或肠道微生物提供了新的策略。

参考文献：

[1] Hu J, Wu Y, Kang L, et al. Dietary D-xylose promotes intestinal health by inducing phage production in Escherichia coli[J]. npj Biofilms and Microbiomes, 2023, 9(1): 79.