干货系列丨THP-1细胞培养小课堂

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发布日期:2024年04月12日
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干货丨THP-1细胞培养小课堂

干货系列丨THP-1细胞培养小课堂

上期小源老师给大家推出了RAW264.7细胞培养干货,受到了大家的一致好评,小源非常感谢各位的鼓励!现在推出第2期细胞培养干货-THP1,带好小本本和笔,一起来上课吧~

THP-1是从急性单核细胞白血病患者的外周血中分离出的单核细胞。在某些诱导分化剂作用下THP-1细胞可以被诱导分化为多种巨噬细胞,是研究炎症、免疫反应等领域的理想模型此外,还可使用CRISPR Cas9技术编辑THP-1细胞进行巨噬细胞作用机制、免疫应答通路研究、炎症疾病治疗开发等研究。

值得注意的是,THP-1悬浮细胞且喜欢酸性环境,它的补液、传代方法与贴壁细胞大有不同,究竟有什么不一样呢?跟着小源来了解一下吧!

首先,了解一下THP-1的基本信息。

细胞名称

THP-1(人单核细胞白血病细胞系)

生长特性

悬浮生长

细胞形态

单核细胞,培养时偶有小聚团是正常现象

细胞培养基

90%RPMI-1640+10%FBS(源井改良

培养环境

CO25%;温度:37℃

换液频次

2-3/

传代比例

2×105~4×105 cells/mL

THP-1细胞生长正常图片 

1 THP-1细胞生长正常图片

细胞复苏

1) 准备工作:将完全培养液置37℃水浴锅预热30分钟。

2) 在超净台内吸取7 mL完全培养液至15 mL离心管中

3) 将细胞从干冰里取出,用镊子夹住盖子放入37℃水浴中快速晃动(注意:水不能没过盖子),使其在1分钟左右完全融化

4) 将细胞悬液转至提前准备好的完全培养液中,盖上盖子,离心1100 rpm室温4分钟;

5) 于超净台内吸弃上清,吸取1 mL完全培养液重悬细胞至单细胞状态,转移至装有4 mL完全培养液的T25 cm2培养瓶(或者6 cm的皿)中,写上细胞名称、复苏日期、代次,放置37℃5% CO2培养箱中培养;

6) 第二天观察细胞状态。

换液:

半换液:细胞状态良好,细胞碎片少,培养基没有变黄的情况

1)将培养瓶竖立静置10-15 min,使细胞自然沉降

2)小心吸一半培养基弃掉(若细胞密度较低,可将吸取的一半培养基转移至离心管后1100 rpm离心4 min,然后用新鲜培养基重悬后放回原瓶培养)

3)原瓶补充一半的新鲜完全培养基

离心换液:细胞状态良好,细胞碎片较多,培养基变黄的情况

1)将所有细胞悬液转移至离心管中

21100 rpm离心4 min。

3)离心结束,弃去上清,加入1 ml PBS重悬后转移至1.5ml EP管中再次离心(此步骤目的是去除细胞碎片,若细胞碎片较多,可用PBS重复清洗2次,若无可省略此步

4)培养瓶中加入适量完全培养基

5)离心结束后用完全培养基重悬细胞沉淀,将细胞悬液接种回培养瓶,置于37℃5% CO2培养箱中培养。

注意事项:

THP-1细胞更喜欢酸性环境在偏酸性环境中,THP-1生长得更好,所以当培养基稍微变黄(呈橘红色)时,是适合细胞生长的,此时补液或半换液即可,避免频繁离心换液

细胞传代:

离心法:

1)将所有细胞悬液转移至离心管中,1100 rpm离心4 min

2)离心结束弃上清,用适量完全培养基轻柔混匀细胞,吸取20 ul细胞悬液进行细胞计数

3)根据计数结果确定传代比例,将细胞密度调整为2×105~4×105个细胞/mL,视细胞培养体积将细胞培养在不同规格的培养瓶中。

4)置于37℃5%CO2培养箱培养

直接分瓶法:

1)用电动移液枪轻柔混匀培养瓶里的细胞

2)吸取20 ul细胞悬液进行细胞计数

3)根据计数结果将细胞密度调整为2×105~4×105个细胞/mL用移液器吸取培养瓶内细胞悬液,均分到若干个新培养瓶中,每瓶再补充适量的新鲜完全培养基

4)置于37℃5%CO2培养箱培养

细胞冻存:

1)将培养瓶里的细胞悬液全部转移至离心管中

2)1100 rpm离心4 min弃上清,加入适量4℃预冷的冻存液重悬细胞,吸取20 ul细胞悬液进行细胞计数,并调整细胞密度至少为2×106~5×106个细胞/mL

3)1 mL/管分装至冻存管中,将冻存管放置于冻存盒中然后转移至-80℃冰箱

4)过夜后,将冻存细胞转移至液氮罐内保存。

注意事项:

1.THP-1细胞对冻存温度比较敏感,建议冻存后立即转入-80℃冰箱,长期保存需放置液氮中。

2.冻存时细胞活率建议大于90%每管冻存细胞数至少在2×106~5×106个细胞/ml。

常见问题及解决方法

1. 培养过程中细胞碎片过多或者药筛后死细胞过多:

细胞碎片多且死细胞多 

细胞碎片多且死细胞多

圆形透亮、饱满、不皱缩的细胞是活细胞若细胞碎片或者死细胞过多,可在细胞进行离心后根据细胞量加入适量PBS重悬,重悬后将细胞悬液转移至1.5ml EP中低速离心(800 rpm离心3 min),离心结束尽可能地吸干净PBS,可重复两次此步骤,根据离心下来的细胞量接种至合适的培养皿中(接种到小的皿中更好培养,先不要接种到大的皿)

2.培养过程中细胞聚团:

少量细胞聚团属于正常现象,若聚团过多,可考虑以下处理方法:

1) THP-1细胞对血清质量有一定要求,可更换更好的血清品牌或者提高血清浓度(不超过20%,血清含量过高也会对细胞有毒性)

2) 控制好细胞密度,不要太稀或者过密

3.冻存复苏活率低(存活率低):

1) 因为thp-1是悬浮细胞易受到冻存的影响,所以需要在冻存时加大细胞密度提高复苏细胞存活率,建议冻存时细胞密度至少在2×106~5×106个细胞/mL

2) 复苏时,若对冻存细胞数量不确定,可细胞复苏至6板的单孔中,待细胞状态恢复转移至更大体积的培养瓶中继续培养。

基因编辑tips

小源拥有N多例THP-1细胞基因编辑经验,一并分享给你~

1.如何提高单克隆形成率?

1) 铺克隆时细胞活率需要>90%

2) 稀释细胞计数后结果最好介于1×106-2×106之间

3) 建议使用优级胎牛血清

4) 铺克隆时建议用PBS清洗两次

2.细胞转染时需要注意什么?

1) 细胞活率>90%,细胞状态正常,肉眼看都是圆形透亮、细胞膜完整的细胞

2) 病毒感染法进行正式实验前建议进行预实验找到最适MOI及最佳药筛浓度;确保感染的病毒滴度达标;感染前添加助染剂Polybrene;感染时建议在24孔板或者12孔板内进行

 

又是干货满满的一天!THP-1细胞质量是实验成功的关键之一,源井的THP-1细胞系经过上百例基因编辑实验优选,源井还可提供基因编辑技术服务,想要轻松获得优质的THP-1细胞可以联系小源,现在野生型细胞买11~

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根据不同细胞特点选择适宜的转染方法(病毒法,化学转染法或电转法)将gRNA序列和Cas9蛋白转入细胞中,并根据不同的转染方法进行不同时长的药筛。药筛完成后进行单克隆筛选,通过靶位点扩增及测序验证筛选出成功敲除的阳性克隆,最终交付纯合子细胞株与相关数据报告。
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