【文献解读】光响应环状gRNA实现时空双重维度精准控制！

【文献解读】光响应环状gRNA实现时空双重维度精准控制！

背景

控制基因组编辑的时间和空间对遗传疾病的治疗和研究遗传变异具有巨大的潜力。尽管近年来CRISPR在治疗领域的精确度、靶向范围和适用性方面都取得了进步，但在时间和空间上控制CRISPR编辑的工具仍然滞后。因Cas核酸内切酶活性长时间保持或不受限而导致的不受控CRISPR系统可能会产生不可预测的脱靶效应。为了解决这一问题，人们提出了多种策略来操纵Cas蛋白的表达或其活性。在某些情况下，核酸内切酶Cas9的产生可以由诱导物调控，还能以分裂或非激活的形式产生，之后可以通过小分子刺激或暴露于双正交触发器(如光)而被激活。而与优化生产功能重组诱导Cas蛋白相比，gRNAs (crRNA或单gRNA)进行修饰简单且成本低廉。

由于认识到gRNA是CRISPR系统中最容易编程的组件，研究人员便着手研究那些可以很容易用最小的修饰进行构建的、能完全消除其招募到目标基因组区域并在光下迅速激活的gRNA。这篇名为“Optical control of CRISPR-Cas editing with cyclically caged guide RNAs”的文章正是报道了来自北京分子科学国家研究中心的Ying-Jie Sun等研究人员利用两或三个预先安装的光不稳定取代基进行简单的共价环化，最终成功通过光敏环状gRNAs实现了由能从时空上调控的高效CRISPR/Cas9和cpf1所介导的基因编辑。在稳定表达Cas9细胞中，环状gRNA在光照射的协同作用下，可以在预先确定的切割区域内精确切割GFP和VEGFA。另外研究人员还在胚胎中实现了光介导的MSTN基因编辑，而一种新的弓结型gRNA在没有光照射的情况下没有显示出背景编辑。总而言之，该研究提供了一种能在时间与空间两个维度精确操纵基因编辑的方法，较于传统的CRISPR/Cas9技术有了显著的改进。

首先，研究人员通过铜催化叠氮化物炔环加成反应(CuAAC)使NPBOM结合寡核苷酸和不同的叠氮连接物制备了环状gRNAs。与具有多个光不稳基团的线性gRNA相比，新型环状gRNA缺乏灵活性。这几种构象的改变不仅破坏了碱基对与目标DNA序列的相互作用，避免了任何部分的进入，而且还抑制了诱导Cas的活性构象进行目标DNA编辑。在光照射下，环状gRNA会迅速释放构象应变，使分子更接近其线性模拟物，从而恢复CRISPR/Cas编辑能力。因此，环形gRNA的光激活控制可以在最小的背景编辑下，以通用的方式快速、无创地激活CRISPR/Cas活性。

体外调控环状crRNA的DNA切割/ CRISPR-Cpf1编辑

通过比较环状GFP-crRNA-c2及其两个线性前体的熔解特性(图1A)发现，与线性crRNAs相比，前者因共价连锁导致其熔点(Tm)显著降低，说明其无法与模板DNA结合，证明CRISPR-Cas9系统中的DNA干扰复合体由于环状crRNA无法识别目标位点或招募Cas9用于DNA切割而功能失调。另外，他们还发现crRNA-c对核酸内切酶降解具有极端稳定性，却会在辐照度为20 mW·cm^–2的365nm UV光照射下，在30秒内释放出线性crRNA(图1C)，这为响应性CRISPR编辑提供了一个极好的响应窗口。通过更进一步的研究发现，这种技术应用于CRISPR-Cpf1系统也是可行的，这意味着他们的光激活环状gRNA策略是调控RNA-引导的CRISPR编辑的通用方法。

图1 体外光诱导CRISPR-Cas9介导的GFP DNA切割

环状crRNA在活细胞中光控CRISPR/Cas9编辑

血管内皮生长因子A是内皮细胞在缺氧和炎症刺激下分泌的一种强效和特异性有丝分裂原。研究人员使用了这种光响应CRISPR-Cas9编辑策略来破坏人类293T细胞中的VEGFA基因。制备对应的NPBOM修饰VEGFA- crRNA -a和环状产物VEGFA- crRNA-c(图2B)，后者也表现出类似的光解离模式，在紫外线照射后不到1分钟就释放出线性的VEGFA- crRNA(图2C)。为了验证在人类细胞中VEGFA基因被光响应性破坏的可能性，他们随后用未经修饰的crRNA感染了组成型表达Cas9的293T-Cas9细胞（由源井生物提供），以靶向VEGFA。采用T7内切酶I(T7E1)错配方法进行检测，发现带有共价连接环的环状crRNA-c在黑暗中显示出9.6%的indel效率，而在紫外线照射5分钟后的indel效率相当（41.8%）。这一结果与使用天然crRNA进行的实验基本相同（53.9%）。综上所述，所有这些结果都证明了利用环状gRNAs实现光响应基因编辑技术的可能性。

源井在该研究中提供了稳定表达Cas9蛋白的293T-Cas9细胞，以验证光响应环状gRNA对293T细胞基因编辑的可能性。目前源井可提供多种Cas9细胞现货助您进行高效简便的基因编辑试验，除此之外KO细胞/野生型细胞/EGFP细胞系等均有现货，现正火热促销，点击查看活动详情>>

图2 光诱导CRISPR-Cas9介导的活细胞基因编辑

最后，研究人员还使用上述方法结合外部光刺激，实现了基于CRISPR/Cas技术的对小鼠受精卵中的MSTN基因编辑的时空控制。通过结合外部光刺激的方法，证实了该双正交激活环状gRNA可用于控制CRISPR系统。他们预测这些特征将被用于研究时空上复杂的生理事件，有助于更好地理解基因调控的动态。

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