CRISPR技术将铜绿假单胞菌研究推向新篇章

基于CRISPR/Cas 9的基因组编辑将加速对铜绿假单胞菌的多功能研究。

· 基因组、蛋白质组和生物学     · 细胞外基质的代谢和维持     · 耐药性     · 分泌系统

基因编辑通常会彻底改变对微生物物种的理解、开发和控制。铜绿假单胞菌是生物膜形成、群体感应、药物靶点和代谢工程研究的模式生物。然而，传统的铜绿假单胞菌遗传操作方法需要多步选择才能产生突变体，并在缺失基因的地方留下疤痕序列。因此，传统的方法仍费时费力。

源井生物研发的CRISPR-B™可高效编辑铜绿假单胞菌的基因。利用CRISPR/Cas9和λ-Red重组系统，可实现铜绿假单胞菌快速、精确、无缝的基因编辑操作。源井生物可以定制铜绿假单胞菌的基因编辑，以及微生物中的各种基因修饰。

硝酸镓（Ganite）是治疗铜绿假单胞菌感染的潜在药物。基于CRISPR/Cas9的基因突变研究表明，铁载体pyochelin介导和ABC转运体是铜绿假单胞菌Ga3+内化的两个主要途径。研究者揭示了Ga3+能抑制铜绿假单胞菌生长和生物膜形成。

铜绿假单胞菌利用pyochelin介导和ABC转运体通路摄取Ga3+和Fe3+的示意图

硝酸镓能改善CF和慢性铜绿假单胞菌肺部感染患者的肺功能，且无任何严重不良反应，该结果显示硝酸镓具有治疗铜绿假单胞菌感染的潜在临床应用价值。

为了研究铜绿假单胞菌摄取镓的分子机制， 研究人员利用CRISPR/Cas9技术，对铜绿假单胞菌模型菌株PAO1中的关键基因进行突变，以分别阻断铁的吸收途径。 研究中共构建了5个不同的PAO1突变体，（1）PAO1ΔhitA突变体阻断经典的高亲和力铁吸收系统ABC转运蛋白，两个突变体（2）PAO1ΔpvdA和（3）PAO1ΔpchF分别阻断了两个铁载体PVD和PCH的生物合成途径，（4）PAO1ΔfeoB突变体失去了高亲和力的内膜铁离子转运体，（5）PAO1Δtesf突变体取消了Tesf介导的铁吸收途径。

图1：铜绿假单胞菌突变体的测序结果

研究人员通过测定在缺铁培养基中Ga(NO3)3对不同菌株的最低抑菌浓度（MICs），分析Ga（III）对野生型（WT）和不同PAO1突变体生长的影响。他们还分析了不同的铁吸收途径对PAO1和PAO1Δtesf突变体摄取镓的影响。在这个双突变株中也观察到细胞内铁水平的显著下降（图3B），这表明 HitABC转运体是铜绿假单胞菌铁摄取的主要贡献者。

图3：铜绿假单胞菌及其突变体细胞内镓含量（A）和铁含量（B）。

HitA是一种存在于细菌周质中的可溶性铁结合蛋白，与单个Fe3+具有很高的亲和力。HitA在Ga3+摄取过程中也有类似的作用。为了揭示这一现象，他们应用细胞热位移分析（CETSA）观察到Ga3+可以在体内与HitA结合。随后，他们进行了金属竞争试验，观察到Fe3+可以很容易地从Ga3+-HitA蛋白中取代Ga3+。研究人员生成了apo-HitA和Fe3+结合以及Ga3+结合的HitA蛋白的高分辨率晶体结构。Ga3+-HitA的结构与Fe3+-HitA相似，Fe3+的配位球与Ga3+位点上确定的几乎相同，因此证实 Ga3+可以模仿Fe3+占据HitA的金属结合位点。

图4：一个不对称单元上两个Fe3+-HitA和Ga3+-HitA链的叠加。金属配位球在两条链上是相同的。

本研究为铜绿假单胞菌内化Ga3+提供分子机制，促进了镓类抗菌药物的开发。

参考文献
Identification and characterization of a metalloprotein involved in gallium internalization in Pseudomonas aeruginosa. ACS Infect Dis 2019, 5(10):1693-1697.
Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions. Front Microbiol 2012, 3:20